Выделение и очистка плазмидных ДНК

Используется специальный набор NucleoBond Xtra для выделения плазмидных ДНК.

Характеристика продукта:

Технология: анионо-обменная хроматография

Формат: Гравитационные колонки

Очистка лизатов: фильтры для колонок

Размер векторов: <300 kbp

Колонки изготовлены из полипропилена, в качестве сорбента используется кремниевая смола. Колонки устойчивы к действию органических растворителей (этанол, хлороформ, фенол) и денатурирующих агентов. Используемая кремниевая смола может быть использована в широком диапазоне pH ( от 2,5 до 8,5). Кроме сорбента в колонки вставлены специальные фильтры, которые позволяют подавать на колонку бактериальный лизат без предварительной очистки от остатков клеточной массы.

Сорбент представляет собой гидрофильную макропористую кремниевую смолу, функциональная группа- метил-амино-этанол. Большое количество функциональных групп обеспечивает высокий положительный заряд в кислой среде, что позволяет отрицательно заряженным фосфатным группам ДНК образовывать связь с сорбентом за счет электростатического притяжения.

Применение:

-Высокопийные плазмиды из E.coli

-Низкокопийные плазмиды из E.coli

Последовательность действий:

1.Культивирование E.coli, получение суточной культуры, отделение клеток в помощью центрифугирования.

Количество и качество плазмидных ДНК очень сильно зависит от питательной среды, антибиотиков, которые добавляются в среду, от бактериальной культуры, размера самой плазмиды, а также от условий культивирования.

Рекомендуемая питательная среда: Luria-Bertani (1% триптона, 0,5 % дрожжевого экстракта, 1% NaCl). Бактериальную культуру следует выращивать при температуре 37 ° C, при постоянном перемешивании на термостатируемой качалке (200-250 об/мин) в течение 12-16 часов. Следует использовать емкости в 3-4 раза больше объема питательной среды, чтобы обеспечить культуру необходимым количеством кислорода. Кроме того, следует избежать “перероста” бактериальной культуры, так как это приведет к большому количеству погибших клеток и, в результате, к разрушению плазмид или загрязнению их хромосомными ДНК.

В любую плазмиду всегда включается ген резистентности к определенному антибиотику, поэтому в питательную среду необходимо добавлять этот определенный антибиотик. Это обеспечивает воспроизведение плазмид и их большое количество в каждой клетке. Без антибиотика в питательной среде клетки постепенно будут терять свою активность в течение всего процесса культивирования, что приведет к низкому выходу конечного продукта.

Рекомендуемые концентрации антибиотиков в среде:

ампициллин 20-60 мкг/мл.

канамицин 10-50 мкг/мл

стрептомицин 10-50 мкг/мл

тетрациклин 10-50 мкг/мл

Штамм E.coli в основном влияет на качество плазмидных ДНК. Такие штаммы как DH5α или XL1-Blue обычно продуцируют плазмиды высокого качества, в то время как при культивировании, например, штамма HB101 с высокой эндонуклеазной активностью качество плазмид низкое.

Размер плазмиды также влияет на конечный выход: чем больше плазмида, тем меньше будет ее количество в бактериальной культуре.

Кроме того, чтобы процесс выделения и очистки плазмидных ДНК был наиболее эффективный, в конце ферментации необходимо обратить внимание на массу клеток в культуральной жидкости. Так как процесс определения бактериальной массы довольно утомительный, этот важный параметр было решено заменить на значение произведения оптической плотности (λ=600 нм) и объема культуральной жидкости (эти две величины измерить гораздо легче).

ODV = OD₆₀₀ x Vol [ mL ]

Рекомендуемое значение ODV= 400 – если используется набор NucleoBond Xtra Midi (средний) и ODV= 1200 - если используется набор NucleoBond Xtra Midi (большой).

2.Лизис бактериальных клеток.

После центрифугирования осадок бактериальной культуры ресуспендируется в буфере RES, после этого добавляется буфер LYS для лизиса. Буферный раствор LYS содержит гидроксид натрия и додецилсульфат натрия (натриевая соль лаурилсульфокислоты, анионоактивное поверхностно-активное вещество). Белки, а также хромосомные и плазмидные ДНК денатурируют в таком растворе.

3.Нейтрализация лизата

Для нейтрализации добавляют NEU буферный раствор, содержащий ацетат калия. В результате химической реакции додецилсульфат калия выпадает в осадок, а вместе с ним осаждаются денатурированные белки, хромосомные ДНК и остатки клеток.

C₁₂H₂₅SO₄Na+ CH₃COOK= C₁₂H₂₅SO₄K + CH₃COONa

Ацетат калия также нейтрализует лизат. А плазмидные ДНК в свою очередь восстанавливают нативную структуру и остаются в растворе.

4.Очистка и загрузка лизата на колонку.

После щелочного лизиса раствор должен быть очищен от остатков клеток и осадка. Это обеспечивается пропусканием раствора через специальный фильтр, который вставляется в колонку.

сорбент

Данный фильтр специально создан, чтобы исключить стадию центрифугирования из процесса выделения и очистки плазмид. Таким образом, происходит одновременная фильтрация и пропускание лизата через слой сорбента.

5.Промывка колонки

Для промывки используется EQU буферный раствор. После промывки фильтр вынимается из колонки и выбрасывается После этого колонка, кже без фильтра, промывается второй раз с помощью буферного раствора WASH.

6.Элюирование

Элюирование плазмид проводят буферным раствором ELU. Элюирование происходит в условиях высокой концентрации соли (KCl) и путем сдвига pH от 7,0 до 9,0. Элюат собирается в пробирки ( 15 мл или 50 мл).

7.Осаждение

Для осаждения добавить изопропанол комнатной температуры. Далее центрифугировать в течение 15 мин и осторожно слить супернатант.

8.Промывка и высушивание осадка ДНК

Добавить 70% этанол к осадку и центрифугировать в течение 5 мин. Пипеткой осторожно удалить супернатант. Оставить осадок для просушки при комнатной температуре.

9.Приготовление концентрированного раствора плазмидной ДНК

Растворить осадок в буферном растворе TE или в очищенной воде. Определение концентрации плазмидной ДНК производится на спектрофотометре при длине волны 260 нм и 280 нм.