Цель, задачи и методы санитарной микробиологии
Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающий микроорганизмы, содержащиеся в окружающей среде и способные оказывать неблагоприятное воздействие на состояние здоровья человека. Она разрабатывает микробиологические показатели гигиенического нормирования, методы контроля за эффективностью обеззараживания объектов окружающей среды, а также выявляет в объектах окружающей среды патогенные, условно-патогенные и санитарно-показательныемикроорганизмы.
Обнаружение патогенных микроорганизмов позволяет дать оценку эпидемиологической ситуации и принять соответствующие меры по борьбе и профилактике инфекционных заболеваний.
Условно-патогенные микроорганизмы могут попадать в продукты питания, быстро размножаться с накоплением большого количества микробных клеток и их токсинов, вызывая пищевые отравления микробной этиологии. Санитарно-показательные микроорганизмы используют в основном для косвенного определения возможного присутствия в объектах окружающей среды патогенных микроорганизмов, они непосредственно могут свидетельствовать о загрязнении объекта выделениями человека и животных, содержащими микроорганизмы. Например, возбудители кишечных инфекций имеют общий путь выделения (с фекалиями) с такими санитарно-показательными бактериями, как бактерии группы кишечной палочки. БГКП (в эту группу, кроме кишечной палочки, входят сходные по свойствам бактерии рода Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella), энтерококки, клостридии перфрингенс; возбудители воздушно-капельных инфекций имеют общий путь выделения с бактериями, постоянно обитающими на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, выделяющимися в окружающую среду при кашле, чиханье, разговоре. В связи с этим в качестве санитарно-показательных бактерий для воздуха закрытых помещений предложены гемолитические стрептококки и золотистые стафилококки.
Загрязненность почвы, воды, воздуха, продуктов питания и других объектов выделениями человека или животных определяют путем количественного учета санитарно-показательных микроорганизмов. В воздухе регистрируют количество зололотистого стафилококка и стрептококков, в воде – кишечной палочки, БГКП, энтерококка, в почве – кишечной палочки, БГКП, клостридии перфрингенс, в продуктах питания – кишечной палочки, БГКП, энтерококка, золотистого стафилококка, протея. На основании количественного выявления санитарно-показательных микроорганизмов вычисляются коли-титр, перфрингенс-титр, титр энтерококка и т.д. Так, например, коли-титр или титр энтерококка воды – это наименьшее количество воды, в котором определяется кишечная палочка или энтерококк.
Показателем загрязненности воды является также коли-индекс – число кишечных палочек в 1 л воды.
Часто вместо коли-титра определяются титр БГКП, к которым относят все грамотрицательные палочки, сбраживающие с образованием кислоты и газа лактозу или глюкозу при температуре 37+0,5ºС в течение 24-48 ч и не обладающие оксидазной активностью. Наиболее часто этот показатель применяют как индикатор фекального загрязнения воды. При бактериальном загрязнении воды свыше допустимых норм следует провести дополнительное исследование на наличие бактерий – показателей свежего фекального загрязнения. К таким бактериям относят кишечную палочку, способную расщеплять лактозу до кислоты и газа при температуре 43-44ºС в присутствии ингибиторов роста (борная кислота) и не растущую на цитратной среде. О свежем фекальном загрязнении свидетельствует также выявление энтерококка. На старое фекальное загрязнение указывают отсутствие БГКП и наличие определенного количества клостридии перфрингенс, т. е. наиболее устойчивых спорообразующих бактерий. Кроме определения патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, в практике санитарно-микробиологических исследований используется определение микробного числа; общего количества микроорганизмов в определенном объеме или определенной массе исследуемого материала (вода, почва, продукты питания, лекарственная форма и др.).
Санитарный надзор за состоянием объектов общественного питания, аптек, лечебных и детских учреждений осуществляется исследованием смывов с рук персонала, посуды, поверхности столов, оборудования и др. Смыв высевают на различные питательные среды для определения микробной обсемененности, наличия БГКП, патогенных энтеробактерий, золотистого стафилококка, грибов рода Candida и энтеровирусов.
Глава 5.
ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Генетика микроорганизмов как учение о наследственности и изменчивости имеет характерные особенности, соответствующие их строению и биологии. Наиболее изучена генетика бактерий, характерными чертами которых являются малые размеры и большая скорость размножения бактериальной клетки, что позволяет проследить генетические изменения в течение небольшого промежутка времени на большом числе популяций. Бактериальная клетка имеет одинарный набор генов (нет аллелей). Хромосома бактерий является полинуклеотидом (две полинуклеотидные цепочки ДНК) длиной 1000 мкм и мол. массой около 1,5.2-10'Д. Она суперспирализована и замкнута в кольцо: содержит от 3000 до 5000 генов. Аналогично хромосоме в цитоплазме бактерий располагаются ковалентне замкнутые кольца ДНК, называемые плазмидами (внехромосомные факторы наследственности). Масса плазмид значительно меньше массы хромосом. Хромосома и плазмида способны к автономному самокопированию – репликации, поэтому их называют репликонами. Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов – почти синоним понятия «генотип».
Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки фе-нотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.
В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.
Ненаследственная (средовая, модификационная) изменчивость обусловлена влиянием внутри- и внеклеточных факторов на проявление генотипа. При устранении фактора, вызвавшего модификацию, данные изменения исчезают.
Наследственная (генотипическая) изменчивость, связанная с мутациями, – мутационная изменчивость. Основу мутации составляют изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, полная или частичная их утрата, т. е. происходит структурная перестройка генов, проявляющаяся фенотипически в виде измененного признака. Наследственная изменчивость, связанная с рекомбинациями, называется рекомбинационной изменчивостью.
Рекомбинации у бактерий
Рекомбинация (ре + лат. combinatio – соединение) – возникновение новых последовательностей ДНК в результате разрывов и последующих восстановлений ее молекул. В итоге таких изменений ДНК бактерий появляются так называемые рекомбинантные штаммы, или рекомбинанты. Процесс рекомбинации у бактерий имеет некоторые отличия, связанные с особенностями их генетического аппарата, форм генетического обмена. Именно на микробных объектах были открыты формы переноса генетического материала – трансформация, трансдукция, конъюгация, неизвестные классической генетике, с помощью которых изучаются молекулярные механизмы генетических рекомбинаций.
В процессе генетического переноса участвуют бактерия-реципиент и бактерия-донор. Степень участия их неравномерна: в реципиентную клетку попадает лишь фрагмент экзогенной ДНК бактерии-донора, который взаимодействует с цельной хромосомой реципиента, в результате чего происходит частичное перераспределение (рекомбинация) генетического материала с образованием рекомбинанта. Все этапы рекомбинации у бактерий обеспечиваются соответствующими ферментами: рестриктазами, лигазами и др. У бактерий различают три типа рекомбинаций: общую, «незаконную» и сайт-специфическую. Общая, или гомологичная, классическая, рекомбинация происходит, если в структуре взаимодействующей ДНК имеются гомологичные участки (от греч. homologia – соответствие). Так называемая «незаконная» рекомбинация для своего осуществления не требует значительной гомологии ДНК взаимодействующих структу для интеграции с негомологичными участками репликонов. Транспозоны – более сложные генетические структуры ДНК, І которые содержат в своем составе IS-элементы и дополнительные гены (например, гены лекарственной устойчивости и др). Подвижные генетические элементы вызывают повреждение или инактивацию генов, слияние репликонов, распространение генов среди бактерий. Общая рекомбинация наиболее эффективна при внутривидовом генетическом обмене, «незаконная» рекомбинация играет важную роль не только в пределах отдельных видов, но и между бактериями различных видов и родов. Третьей разновидностью рекомбинации является так называемая сайт-специфическая рекомбинация (от англ, seit – местоположение, участок), для осуществления которой необходимы строго определенные последовательности ДНК и специальные ферменты. Сайт-специфическая рекомбинация происходит в I менее протяженных участках генома (в пределах 10-20 пар нук-леотидов), например при включении профага в строго ограниченные участки (сайты) хромосомы.
Наиболее изучены три типа передачи ДНК, отличающиеся I друг от друга способом ее транспортировки: трансформация, 1 трансдукция, конъюгация.
Трансформация
Трансформация (от лат. transformatio – превращение) заключается в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной растворимой форме, передается бактерии-реципиенту. При трансформации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий родственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологичных участков собственной и проникшей извне ДНК.
Впервые І явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмо- і кокка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм І пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулентный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пневмококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пневмококка. О. Звери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) доказали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов. Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. Приизучении генетической трансформации у бактерий были разработаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.
Трансдукция
Трансдукция (от лат. transductio – перенос, перемещение) – передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмента ДНК донора, и специфическую – перенос определенного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента.
Неспецифическая трансдукция обусловлена включением ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая трансдукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привносятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизогенией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего продукта, такая трансдукция называется абортивной.
Конъюгация
Конъюгация (от лат. conjugatio – соединение) описана Дж. Ледербергом и Э. Татумом (1946), работавшими с мутантами кишечной палочки. Конъюгация бактерий состоит в переходе генетического материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клетку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор (от англ, fertility –плодовитость), который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей.
Клетки, не содержащие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора ни превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фактора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контролирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F+; они передают F-фактор клеткам, обозначаемым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ, high frequency of recombination – высокая частота рекомбинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F~хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клетку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин. Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента -происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъюгации бактерий, можно определять последовательность расположения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выходе из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так 1 называемый замещенный фактор – F'.
При конъюгации происходит только частичный перенос генетического материала, поэтому ее не следует отождествлять полностью с половым процессом у других организмов. Важными факторами генетической изменчивости являются 1 плазмиды.
Плазмиды
Плазмиды – внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1.5 % ДНК хромосомы. Плазмиды способны автономно копироваться (реплицироваться) и существовать в цитоплазме клетки, поэтому в клетке может быть несколько копий плазмид. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.
Термин «плазмиды» впервые введен американским ученым Дж. Ледербергом (1952) для обозначения полового фактора бактерий. Плазмиды несут гены, не обязательные для клетки-хозяина, придают бактериям дополнительные свойства, которые в определенных условиях окружающей среды обеспечивают их временные преимущества по сравнению с бесплазмидными бактериями.
У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды, несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам – антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды, или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды, детерминирующие продукцию энтеротоксина.
Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например возбудителей чумы, столбняка, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, контролировать синтез белковых антибиотикоподобных веществ – бактериоцинов, детерминируемых плазмидами бактериоциногении, и т.д. Существование множества других плазмид у микроорганизмов позволяет полагать, что аналогичные структуры широко распространены у самых разнообразных микроорганизмов.
Плазмиды подвержены рекомбинациям, мутациям, могут быть элиминированы (удалены) из бактерий, что, однако, не влияет на их основные свойства. Плазмиды являются удобной моделью для экспериментов по искусственной реконструкции генетического материала, широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных штаммов (см. главу 6). Благодаря быстрому самокопированию и возможности конъюгаци-онной передачи плазмид внутри вида, между видами или даже родами плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий.
Мутации
Мутации (от лат. mutatio – изменение) – наследуемые изменения в генотипе, не связанные с явлениями рекомбинаций. Мутации определяются изменениями последовательности нуклеотидов в ДНК. Изменения последовательности нуклеотидов в ДНК могут быть следствием разных процессов: ошибка при репликации, выпадение участков (делеция), перемещение отдельного участка относительно другого (транслокация) и др.
Мутации у бактерий обнаруживаются по изменению любого известного признака микроорганизма (например, способность синтезировать аминокислоту, чувствительность к антимикробным препаратам и др.). Существуют различные типы мутаций. По происхождению мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Первые возникают без вмешательства экспериментатора, вторые – в результате воздействия мутагенов на бактериальную популяцию, т. е. физических, химических или биологических факторов, способных вызывать мутацию. К мутагенам относятся различные виды радиации, температура, ряд химических соединений (нитраты, нитриты, бромурацил, 2-аминопурин, нитрозогуанидин и др.).
Мутации подразделяют на прямые и обратные, если речь идето направлении мутационного изменения. Мутации, возникающие в геноме «дикого типа» у бактерий в естественных условиях обитания, называются прямыми. Образовавшиеся особи являются мутантами. Мутации, завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому, называются обратными, или реверсией. Особи, возникшие в результате обратных мутаций, называются ревертантами. В настоящее время отдельные реверсии и лежащие в их основе механизмы изучены лишь у бактерий и вирусов. Предполагается достаточно универсальный характер этих процессов. Реверсии возникают под действием тех же факторов окружающей среды, которые вызывают появление прямых мутаций. Реверсия может быть «истинной» в результате восстановления первоначального состояния мутантного гена; если она происходит за счет дополнительной мутации, то называется супрес-сорной мутацией.
Большинство происходящих в ДНК изменений приводит к вредным мутациям либо вызывает гибель микроорганизмов. Поэтому все клетки имеют особые механизмы реконструкции, исправления повреждений, называемые репарационными.
Одной из форм мутаций является диссоциация (от лат. dissociatio – расщепление) – возникновение в популяции микроорганизмов особей, отличающихся от исходных микроорганизмов внешним видом и структурой колоний, так называемых S-и R-форм (от англ, smooth – гладкий, rough – шероховатый). S-формы колоний – круглые, влажные, с блестящей гладкой поверхностью, ровными краями; R-формы образуют колонии неправильной формы, непрозрачные, сухие с зазубренными краями и неровной шероховатой поверхностью. Различному внешнему виду колоний соответствует ряд свойств. Чаще S-формы более вирулентны, клетки имеют нормальную морфологию, биохимически более активны, обычно выделяются в остром периоде заболевания; у капсульных видов хорошо развиты капсулы, у подвижных видов имеются жгутики. Гладкие (S) и шероховатые (R) колонии являются крайними формами диссоциации, между которыми могут встречаться переходные формы. Диссоциация рассматривается как явление генетической природы, связанное с хромосомными мутациями генов, контролирующих синтез липополисахаридов клеточной стенки бактерий. Диссоциация известна у многих видов. Обычно она выявляется в стареющих культурах. Диссоциация возникает и в природных условиях (у патогенных микроорганизмов в живом организме). Большинство микроорганизмов имеет полноценные свойства, находясь в S-форме, однако существуют исключения: для ми-кобактерий туберкулеза, бацилл сибирской язвы и возбудителя чумы нормальной является R-форма колоний.