Методы введения рекомбинантных молекул в клетки
1. Трансформация — процесс поглощения клеткой организма свободной молекулы ДНК из среды и встраивания её в геном, что приводит к появлению у такой клетки новых для неё наследуемых признаков, характерных для организма-донора ДНК. Иногда под трансформацией понимают любые процессы горизонтального переноса генов, в том числе трансдукцию, конъюгацию и т. д. В любой популяции лишь часть бактерий способна к поглощению из среды молекул ДНК. Состояние клеток, при котором это возможно, называют состоянием компетентности. Обычно максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце фазы логарифмического роста. Поглощаемая ДНК должна быть двухнитевой (эффективность трансформации однонитевой ДНК на порядки ниже, однако несколько возрастает в кислой среде), её длина — не менее 450 пар оснований. Для некоторых бактерий поглощаемая ДНК должна содержать определённые последовательности. ДНК необратимо адсорбируются на ДНК-связывающем белке, после чего одна из нитей разрезается эндонуклеазой на фрагменты длиной 2—4 тыс. пар оснований и проникает в клетку, вторая полностью разрушается. В случае, если эти фрагменты имеют высокую степень гомологии с какими-либо участками бактериальной хромосомы, возможна замена этих участков на них. Поэтому эффективность трансформации зависит от эволюционного расстояния между донором и реципиентом. Общее время процесса не превышает нескольких минут. Впоследствии, при делении, в одну дочернюю клетку попадает ДНК, построенная на основе исходной нити ДНК, в другую — на основе нити с включённым чужеродным фрагментом (выщепление).2. Микроинъекции. Принципиальное преимущество микроинъекций в том, что они позволяют эффективно создать трансгенные животные, но их серьезные недостатки: нельзя вводить гены в клетки на более поздних стадиях, в процессе интеграции происходит множество перегруппировок, в геноме оказывается множество копий встраиваемой ДНК, и, наконец, интеграция происходит в произвольное место генома случайным образом. 3. Инфицирование (рекомбинантные фаги и вирусы). ДНК фага встраивается в геном и воспроизводится с каждым циклом репликации. 4. Электропорация. Электропорация – воздействие на клетки электрическим импульсом. При этом в клетках образуются поры, через которые проникает ДНК.5. Бомбардировка микрочастицами с адсорбированной ДНК. ДНК или РНК преципитируется на микрочастицах золота. Стреляет сжатым гелием, ДНК с носителем находится в микрокапсуле. 6. Липосомы (комплекс ДНК с липидами). Гидрофобная частица, состоящая из двойного слоя липидов ,без труда проходит в клетку эндоцитозом. ДНК защищена от разрушения ферментами эндосом. Метод применяется для получения трансгенных животных.
81. Методы получения фрагментов ДНК для клонирования.
ПЦР – это один из методов синтеза определенных последовательностей ДНК in vitro. В реакции используются два праймера, которые гибридизуются (отжигаются) с противоположными нитями и фланкируют последовательность ДНК, которую необходимо амплифицировать. Поскольку фрагмент ДНК, синтезированный в данном цикле может служить в качестве матрицы в следующем цикле, то количество копий заданной последовательности ДНК удваивается в каждом цикле. Повторные серии циклов, включающие денатурацию матрицы, отжиг праймеров и их последующее наращивание с помощью ДНК-полимеразы приводят к экспоненциальному накоплению специфического фрагмента ДНК, концы которого заданы 5’-концами праймеров.
Синтез кДНК (cDNA)Синтез кДНК – это ферментативный синтез двуцепочечной ДНК с использованием в качестве матрицы поли(А)-мРНК.
Первичным субстратом служит биологически активная поли(А)-мРНК, изолированная из эукариотических тканей или культуры клеток и очищенная на олиго (dT)-целлюлозе (афинная хроматография).
Обратные транскриптазы Это РНК-зависимые ДНК-полимеразы у некоторых РНК-содержащих вирусов, которые на матрице геномной РНК синтезируют ДНК-копии РНК. Обычно используют обратные транскриптазы, кодируемые вирусом миелобластоза птиц (AMV) или вирусом лейкемии мышей Малони (MMLV).