Пропитывание материала уплотняющими веществами
Для технического удобства при изготовлении тонких срезов стандартной толщины образцы обычно заключают в специальный материал, который должен быть достаточно твердым, но в тоже время и мягким, пластичным для резки бритвой на микротоме. В качестве такого материала в ботаническоймикротехнике чаще всего используют парафин с добавлением воска, а в зоологической – целлоидин. В последнее время часто используются различные полимерные материалы. Для сохранения целостности мембран клеток и их компонентов материал необходимо обезвоживать постепенно, проводя через серию спиртов возрастающих концентраций с интервалом в 10 – 20 %. Затем также градуально замещают спирт на растворитель уплотняющего вещества (например, для парафина – толуол или ксилол). После этого, производят заключение образцов в уплотняющий материал (парафин, целлоидин и т.д.), в котором они могут храниться длительное время (желательно в холодильнике).
Фиксированный в формалине материал пригоден для общегистологических и некоторых гистохимических методов окрашивания (белки, жиры, жирные кислоты, мукополисахариды и др.), а также при различных способах серебрения. Формалин всегда содержит примесь муравьиной кислоты, ацетона и метилового спирта, которые при общих методах обработки материала особого влияния не оказывают, но при серебрении мешают. Для их нейтрализации формалин наливают в темную банку, на дно которой насыпают порошок мела (карбоната кальция) или магния сульфата в объеме 1:10. Жидкость встряхивают. Через сутки обычно формалин имеет нейтральную реакцию, что подтверждается лакмусовой бумагой.
Этиловый спирт (этанол) — для фиксации употребляют как абсолютный, так и 96% спирт. Абсолютный спирт меньше деформирует клетки. По сравнению с формалином этиловый спирт слабее проникает в ткани, поэтому кусочки следует брать не толще 3—5мм. Продолжительность фиксации — от нескольких часов до 1 суток. В 96% спирте возможно длительное хранение объектов и после окончания фиксации, но с этой целью их лучше перенести в 80% спирт. Рыхлые, отечные, слизистоперерожденные ткани в спирте сильно сморщиваются.
Спиртовая фиксация употребляется при исследовании железа, бактерий, гликогена, окраске по Нисслю. Ее положительным качеством является способность одновременного обезвоживания объектов, сокращающая этап заливки, в целлоидин или парафин. Спиртовая фиксация позволяет резать ткань и на замораживающем микротоме. Для этого кусочки отмывают от спирта в проточной воде в течение 3—6 ч. Промывание проводят в широко-гордой банке, завязав ее горло марлей. Отмытые от спирта кусочки (кроме кусочков легких и жировой ткани) тонут в воде.
Метиловый спирт (метанол) является наилучшим фиксатором высушенных на воздухе мазков крови и красного костного мозга. В абсолютный метиловый спирт, налитый в герметично закрытый стакан, стекла с мазками помещают на 5—10 мин, затем просушивают, поставив ребром на фильтровальную бумагу. При этом строго выполняют правила работы с отравляющими веществами!
Ацетон используют в качестве быстрого фиксатора, если требуется неотложное исследование, а замораживающий микротом использовать не представляется возможным. Ацетон сильно сморщивает ткани. Для фиксации берут маленькие кусочки (2х3 мм). Фиксацию проводят в течение 2—3 ч в двух порциях ацетона. Пригоден только обезвоженный, прозрачный, бесцветный ацетон.
Сулема — используют ее насыщенный раствор (10 г сулемы на 100 мл дистиллированной воды или физиологического раствора). Кусочки не толще 3 мм фиксируют 6—12 ч, потом промывают в проточной воде 24—48 ч и заливают в парафин. Чаще употребляют сулему в составе ценкеровской жидкости. Необходимо помнить, что сулема — сильный яд. При употреблении сулемовых фиксаторов нельзя пользоваться металлическими инструментами.
Сложные фиксаторы. Ценкер-формол является хорошей фиксирующей смесью. Приготовление:
1. В отдельной посуде готовят жидкость Мюллера (в 100 мл дистиллированной воды растворяют при нагревании 2,5 г калия бихромата и 1 г натрия сульфата);
2. К 100 мл жидкости Мюллера добавляют 5 г сулемы и 10 мл формалина.
Продолжительность фиксации не более б ч. Промывка в проточной воде — 24 ч. Для удаления из кусочков сулемы их переносят в 70% спирт, содержащий 10% настойку йода, или спиртовыййодкалиевый раствор (2 г йода и 3 г калия йодида растворяют в 100 мл спирта до получения цвета крепкого чая). Если через 24 ч после опускания кусочков раствор обесцветится, их переносят в новую порцию йодированного спирта до того момента, пока раствор не перестанет изменять цвет. Это наиболее пригодный фиксатор для гематологических исследований, если в дальнейшем для окрашивания срезов или мазков пользуются азур-эозином, краской Романовского—Гимзы. Фиксатор дает хорошие результаты при цитологических исследованиях.
Жидкость Буэна готовится перед использованием. К 75 мл заранее приготовленного насыщенного водного раствора пикриновой кислоты прибавляют 25 мл формалина и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Фиксация не менее 4—24 ч. Увеличение срока фиксации улучшает результаты. Из фиксатора кусочки переносят в три порции 70% спирта, обезвоживают, заливают в парафин. Фиксатор пригоден для изучения соединительной и мышечной тканей, эндокринных желез, кишечника.
Жидкость Карнуа состоит из абсолютного спирта (6 частей), хлороформа (3 частей), ледяной уксусной кислоты (1 части). Представляет собой хороший фиксатор для ускоренных исследований. Кусочки толщиной до 4 мл фиксируют 2—3 ч, затем переносят в абсолютный спирт и заливают.
Смесь спирта с формалином (5—10% раствор формалина в спирту 70—96% концентрации). Продолжительность фиксации 24—48 ч.
Жидкость Шафера — универсальный фиксатор, пригоден для изучения белков. Состав: 2 части 96% спирта и 1 часть формалина. Фиксация в течение 1—2 суток, затем только в 96% спирте.
Жидкость Чиаччо пригодна для выявления липидов и липоидов. Состав: 80 мл 5% раствора калия бихромата, 20 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты. Фиксация в течение 2 суток.
Жидкость Бекера: 80 мл дистиллированной воды, 1 г кадмия хлорида, 10 мл 10% раствора кальция хлорида, 10 мл формалина. Фиксация в течение 1 — 5 недель. Затем рекомендуется выдержать материал в течение 1 — 2 суток в 3% растворе калия бихромата. Фиксатор пригоден для гистохимических исследований липидов.
Фиксатор Лилли используется для выявления мукополисахаров и мукопротеинов. Состав: 8 г нитрата свинца, 10 мл формалина, 10 мл воды, 80 мл этанола. Фиксация — при комнатной температуре 24 ч.
Если возникает потребность фиксированный в формалине материал окрасить азурэозином по Гейденгайну или Малори, срезы дополнительно фиксируют в хромовых или сулемовых жидкостях. Срезы, полученные на замораживающем микротоме, после фиксации в формалине можно дополнительно обработать хромовыми растворами или сулемой.