Приготування препаратів фіксованих і пофарбованих клітин
Переважна більшість бактеріальних клітин безбарвні, а також серед бактерій відові види, що здатні рухатись. Такі особливості дещо перешкоджають дослідженню їх морфологічних особливостей. Мікроскопіювання бактеріальних клітин найбільш зручно проводити при підготовці фіксованих забарвлених препаратів.
Фіксованими вважають клітини мікроорганізмів, у яких перервані життєві процеси, але цілком збережена тонка структура. Пофарбовані фіксовані клітини і деталі їхньої будови різкіше виділяються на фоні препарату. Це полегшує вивчення форми, розмірів, внутрішніх елементів (ядра, оболонки, спор, включень), спрощує підрахунок кількості клітин. Фіксовані препарати звичайно розглядають з імерсією. Приготування таких препаратів має такі етапи: приготування мазка, висушування, фіксація та фарбування.
Приготування мазка. На знежирене предметне скло нанести маленьку краплю очищеної води і петлею перенести в неї невелику кількість досліджуваного матеріалу, як для препарату „роздавлена крапля”. Одержану суспензію рівномірно розподілити петлею або краєм покривного скла на площі 1 – 2 см2 якомога тоншим шаром, щоб вона висихала майже відразу після приготування мазка.
Сушіння мазка. Найкраще сушити препарат при кімнатній температурі на повітрі. Якщо мазок висихає повільно, препарат можна злегка нагрівати у струмені теплого повітря, тримаючи скло високо над полум’ям пальника мазком догори. Цю операцію слід виконувати дуже обережно, не перегріваючи мазок, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.
Фіксація.Цей процес має на меті вбити мікроорганізми, тобто зробити їх безпечними, якщо вони патогенні; забезпечити найкраще прилипання клітин до скла, зробити мазок більш сприятливим до фарбування (мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі). Поширений спосіб фіксації – термічна обробка. Для цього препарат треба тричі пронести через найгарячіше полум’я пальника, тримаючи предметне скло мазком догори. Не слід сильно перегрівати мазок, оскільки можуть статися грубі зміни зовнішнього вигляду клітини і внутрішніх клітинних структур (зморщування). Іноді застосовують хімічні способи фіксації: занурюють предметне скло з мазком у мензурку з 96 %-м етанолом на 15 – 20 хв, з безводним метанолом на 3 – 5 хв, з розчином Никифорова на 15 – 20 хв, із сумішшю 96 %-го етанолу і 40 %-го формаліну (співвідношення 95:5) на 2 хв. Можна фіксатор наливати безпосередньо на мазок і витримувати зазначений час. Після закінчення фіксації мазок обережно промивають легким струменем здистильованої води й фарбують.
Фарбування. Розрізняють прості, складні і диференціальні способи фарбування мікроорганізмів. При простому фарбуванні частіше використовують один барвник і профарбовують усю клітину. Це дає можливість чітко визначити форми і розміри клітин. Складне фарбування передбачає застосування двох або декількох барвників, наприклад, діагностичне визначення відношення бактерій до фарбування за Грамом. Диференціальне фарбування засноване на індивідуальному відношенні біологічних структур клітин до різних барвників (фарбування спор, оболонки, ядра капсул, метахроматина й ін.).
Техніка фарбування. Фіксований препарат вмістити на паралельні скляні мостики, які лежать на стінках кристалізатора, і облити з піпетки кількома краплинами розчину вибраного барвника. Слід звертати увагу на те, щоб кінець піпетки не торкався мазка. Тривалість фарбування – від декількох секунд до 1 – 3 хв. Необхідно стежити, щоб під час фарбування розчин барвника на мазку не підсихав, і у разі потреби доливати нові порції. Після закінчення фарбування препарат промити струменем води доти, поки вода, що стікає, стане безбарвною. Потім препарат висушити на повітрі або обережно промокнути фільтрувальним папером і мікроскопувати з імерсією.
Фарбування ендоспор. Для фарбування ендоспор застосовують спеціальні складні методи, тому що багатошарова оболонка і кортекс спори важко проникні для основних барвників. З метою розпушення оболонки ендоспор фарбування мазків проводять сильним барвником при нагріванні, потім цитоплазму знебарвлюють і додатково фарбують у контрастний колір.
Фарбування за методом Пєшкова. Приготовлений тонкий мазок 2 – 3-добової культури бактерій фіксують на полум’ї пальника або сумішшю 5 частин 40 %-го формаліну і 95 частин 96 %-го етанолу впродовж 4 хв. Після фіксації мазок заливають метиленовою синню і доводять до кипіння, тримаючи предметне скло над полум'ям пальника. Тривалість фарбування 10 – 20 с. У міру випарювання додають нові порції фарби. Далі препарат ретельно промивають водою і протягом 30 с дофарбовують 0,5 %-м розчином нейтрального червоного. Знову препарат промивають водою, висушують і мікроскопують з імерсією. Мікроскопічна картина: спори – блакитні або сині (молоді спори – темно-сині), цитоплазма вегетативних клітин – рожева або червона.
Фарбування за методом Златогорова. Мазок спороутворювальних бактерій висушують на повітрі. Для фіксації та розпушення оболонок ендоспор мазок не менш 10 разів проводять над полум’ям пальника. На препарат кладуть смужку фільтрувального паперу, рясно змочують карболовим фуксином Циля, підігрівають 8 – 10 хв до появи пари (але не до кипіння). При цьому важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихав. Тому періодично додають нові порції фарби. Потім папір знімають і 6 – 10 с препарат знебарвлюють 5%-м розчином сульфатної кислоти і промивають водою. Вегетативні клітини при цьому знебарвлюються та їх додатково 2 хв фарбують метиленовою синню. Мазок знову промивають, сушать фільтрувальним папером і мікроскопують з імерсією. При правильно виконаних операціях спори фарбуються в яскраво-червоний колір і чітко виділяються на синьому фоні цитоплазми.
Фарбування за методом Леффлера в модифікації Пєшкова. Досліджувану культуру бактерій щодня протягом 2 – 3 днів пересівають на свіже напіврідке середовище, що містить не більш 0,5 % агару. Клітини петлею обережно переносять у пробірку зі стерильною водою, підігрітою до температури, при якій культура вирощувалася. Краплю отриманої суспензії переглядають під мікроскопом і переконуються, що клітини добре рухливі і щільність суспензії становить 5 – 10 клітин у полі зору. Перед приготуванням мазка скло 3 – 4 рази проводять над полум’ям пальника, потім охолоджують і обпалену поверхню пастерівською піпеткою або петлею наносять 3 – 4 маленькі крапельки приготовленої суспензії бактеріальних клітин. Крапельки мають розтікатися по склу і швидко висихати. При тривалому висиханні бактерії часто втрачають джгутики. Висушений мазок заливають протравленням, витримують 15 хв без нагрівання, після чого протравлення змивають здистильованою водою. Далі препарат фарбують 5 хв розведеним водою фуксином Циля (1:1), занурюючи його мазком вниз у розчин барвника. Пофарбований мазок промивають водою, висушують на повітрі і розглядають з імерсією. При мікроскопуванні звертають увагу на розташування джгутиків, їхню кількість і довжину.
Фарбування капсул у бактерій. Для виявлення капсул застосовують спосіб негативного контрастування за допомогою чорної туші.
1. Негативне контрастування можна комбінувати з прижиттєвим фарбуванням клітин. Для цього краплю досліджуваної суспензії бактерій вмістити у краплю розбавленого розчину фуксину, потім змішати з краплею туші, накрити покривним склом і мікроскопувати з сухим об’єктивом.
2. Краплю бактеріальної суспензії внести у краплю карболового фуксину і залишити на 3 – 5 хв. Додати одну краплю туші й витримати з імерсією.
У полі зору на чорному тлі добре помітні червоні бактеріальні клітини і безбарвні капсули.
Фарбування бактерій за Грамом. Метод запропонований данським вченим Грамом у 1884 р. Суть фарбування полягає в тому, що при обробленні генціанвіолетом та йодом у клітинах одних мікроорганізмів (грампозитивних) утворюється стійкий і не розчинний у спирті комплекс, клітини інших мікроорганізмів (грамнегативних) після оброблення зазначеними барвниками легко знебарвлюються спиртом і набувають червоного кольору при подальшому обробленні фуксином.
Здатність забарвлюватися за Грамом залежить від фізико-хімічного складу оболонки цитоплазми і віку культури, тому фарбувати, за Грамом, завжди слід молоді, найчастіше однодобові культури.
Фарбування за Грамом виконують так. На знежиреному предметному склі приготувати три мазки з різних культур. У центр нанести мазок досліджуваного мікроорганізму, ліворуч і праворуч – мазки контрольних мікроорганізмів; грампозитивні – стафілококи, сарцини; грамнегативні – кишкова паличка. Мазки висушити на повітрі, фіксувати над полум’ям пальника. На фіксовані мазки покласти смужку фільтрованого паперу і налити розчин карболового генціанвіолету. Мазки фарбувати протягом 1 – 2 хв. Папір з барвником зняти і, не промиваючи водою, обробляти мазок розчином Люголя протягом 1 – 2 хв до повного почорніння. Потім розчин злити, препарат промити водою і 30 с обробляти етиловим спиртом для знебарвлення, для чого занурити предметне скло 2 – 3 рази в склянку зі спиртом або налити спирт на мазок. У цьому разі скло злегка похитувати і спирт змінювати кілька разів. Далі препарат промити водою і додатково забарвити водним розчином фуксину протягом 1–2хв. Фуксин злити, препарат знову промити водою, висушити і мікроскопувати з імерсією.
За правильного фарбування грампозитивні бактерії забарвлені в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні – в червоний – колір фуксину.