Эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы

Применяют для обнаружения антигенов N.meningitidis в спин­номозговой жидкости в РИГА.

Коклюшная вакцина.Содержит взвесь B.pertussis, убитых формалином. Применяют для обязательной активной специ­фической профилактики коклюша. Входит в состав АКДС (ад­сорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина), которая включает также очищенные концентрированные диф­терийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате оксида алюминия.

Иммуноглобулин нормальный человеческий.Получен из пла­центарной или венозной крови человека. Содержит специфи­ческие антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяют для создания пассивного иммунитета с целью профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки.Применяют для серологической дифференциации возбудите­лей коклюша.

Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин(АД). Дифтерийный экзотоксин обезвреживают формалином при на­гревании, а затем очищают от балластных веществ, концент­рируют и адсорбируют на гидрате оксида алюминия. Приме­няют для профилактики дифтерии путем создания активного иммунитета. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка.Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана­токсином, очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность сыворотки изменяется в международных единицах. Применяют для экстренной профилактики и лечения дифте­рии за счет создания пассивного иммунитета.

Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка(полива­лентная и типовые). Применяют для дифференциации C.diph­theriae от дифтероидов.

Антимикробные препараты:пенициллин и другие р-лактамы, хлорамфеникол, рифампицин, сульфаниламиды, тетрациклин, эритромицин.

Тема 14.3. ВОЗБУДИТЕЛИ ТУБЕРКУЛЕЗА, ПРОКАЗЫ И АКТИНОМИКОЗА

План

А Программа

1. Биологические свойства возбудителей туберкулеза, микобактериозов, проказы и актиномикозов; их пато-генность, экология, особенности инфекции и эпиде­миология вызываемых заболеваний.

2. Микробиологическая диагностика.

3. Диагностические, профилактические и лечебные пре­параты.

▲ Демонстрация

1. Мазки для микроскопии:

1) Mycobacterium tuberculosis — мазки из чистой куль­туры и мокроты, окраска по методу Циля—Ниль­сена;

2) препарат М.tuberculosis в люминесцентном микро­скопе;

3) Mycobacterium leprae — мазок со слизистой оболоч­ки носа, окраска по методу Циля—Нильсена;

4) Actinomyces spp. — друзы актиномицетов в ткани легкого.

2. Питательные среды для культивирования M.tuberculo-sis.

3. Рост микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена.

4. Ниациновая проба для идентификации М.tuberculosis.

5. Определение чувствительности микобактерий к про­тивотуберкулезным препаратам.

6. Рост актиномицетов на питательных средах.

7. Биохимические признаки для дифференциации акти­номицетов.

8. РСК для серодиагностики актиномикоза.

Задание студентам

1.Микробиологическое исследование при туберкулезе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: окрасить по методу Циля—Нильсена приготовленные из мокроты маз­ки и провести микроскопическое исследование. Сде­лать заключение и наметить ход дальнейшего ис­следования для подтверждения бактериоскопичес-кого диагноза;

3) бактериологический метод:

♦ отметить характер роста_ц исследуемой культуры на среде Левенштейна—Йенсена,

♦ отметить результаты ниациновой пробы,

♦ определить чувствительность М.tuberculosis к ан­тимикробным препаратам: отметить наличие или отсутствие^ роста микобактерий на среде Левен­штейна—Йенсена с разными концентрациями противотуберкулезных препаратов и сопоставить полученные данные с клиническими границами устойчивости микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.

2. Микроскопическое исследование при проказе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать и зарисовать окрашенный по методу Циля—Нильсе­на мазок со слизистой оболочки. Сделать заключе­ние. 3. Микробиологическое исследование при актиноми-

козе:

1) указать материал, подлежащий исследованию;

2) бактериоскопический метод: микроскопировать пре­парат из патологического материала. Сделать за­ключение;

3) бактериологический метод: на основании результа­тов исследования (морфологических, культураль-ных и биохимических свойств) идентифицировать культуру актиномицетов. Сделать окончательное за­ключение.

Методические указания

• Микробиологическая диагностика туберкулеза

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: при легочном тубер­кулезе материалом для исследования являются мокрота, про­мывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, плев­ральный экссудат, промывные воды желудка. Образцы мокро­ты необходимо собирать в течение 3—6 дней. Если пациент откашливает недостаточное количество мокроты, отделение можно облегчить (индуцировать) путем вдыхания аэрозоля по­догретого гипертонического (5—15 %) раствора поваренной со­ли. При внелегочном туберкулезе материал для исследования выбирают в зависимости от локализации поражений. Это мо­жет быть кровь, спинномозговая жидкость, моча, синовиаль­ная жидкость, тканевые биоптаты (лимфатических узлов, кост­ного мозга, печени, кожи и подкожной жировой клетчатки и др.), испражнения. Нестерильный материал, контаминирован-ный нормальной микрофлорой (мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярная жидкость, промывные воды же­лудка, материал из пораженных участков кожи и подкожной жировой клетчатки, испражнения) для предотвращения раз­множения посторонних бактерий сразу после отбора должен быть помещен в холодильник и храниться до исследования при температуре 4—8 °С.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:

Первичная обработка клинического материала.Нестерильный материал нуждается в предварительной деконтаминации (унич­тожении посторонней микрофлоры). Для исследования вязко­го и негомогенного материала, содержащего тканевой детрит (мокрота, бронхоальвеолярная жидкость и др.), требуется так-

же произвести процедуру разжижения и гомогенизации. По­скольку клинические образцы обычно содержат малое количе­ство микобактерий, желательно производить обогащение ис­следуемого материала. Обычно с целью гомогенизации/декон-таминации материал обрабатывают муколитическими (N-аце-тил-Ь-цистеин) и антибактериальными агентами (10 % г4азР0₄, 1—2 % NaOH и др.). Далее бактерии концентрируют путем осаждения (центрифугирование 15—20 мин при 3000 g). При этом клеточный детрит и погибшие посторонние микроорга­низмы удаляются в виде супернатанта. Осадок ресуспендируют в минимальном объеме стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия и используют для дальнейшего иссле­дования. Применяют и другие методы деконтаминации, гомо­генизации и обогащения материала. Тканевые биоптаты перед исследованием необходимо гомогенизировать.

Бактериоскопическое исследование(схема 14.3.1). Бактерио-скопическая диагностика туберкулеза основана на выявлении в материале кислотоустойчивых бактерий с помощью специ­альных сложных методов окраски.

Выявление микобактерий классическим методом Циля— Нильсена является весьма трудоемкой процедурой. Кислото­устойчивые бактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, рас­полагаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 2.2.2). Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации М.tuber­culosis от M.smegmatis, которые могут находиться в моче здоро­вых людей. В отличие от М.tuberculosis они обесцвечиваются спиртом. Мазок исследуют иммерсионным методом при уве­личении 900х—ЮООх, просматривая до 300 полей зрения. Ре­зультат считается положительным при обнаружении 1 или бо­лее кислотоустойчивых бактерий на 100 полей зрения. Отсут­ствие кислотоустойчивых бактерий при просмотре 300 полей зрения следует трактовать как отрицательный результат. Ок­раску по методу Циля—Нильсена применяют преимуществен­но для изучения выделенных чистых культур.

В качестве основного метода выявления микобактерий в материале от больного в настоящее время применяют люми­несцентную микроскопию мазков, окрашенных флюорохро-мом аурамином О по методу Боя (последующая обработка 3 % раствором НС1 в абсолютном этаноле обеспечивает обесцвечи­вание некислотоустойчивых бактерий). Этот метод облегчает исследование, поскольку позволяет использовать меньшее уве­личение (250х или 450х) и просматривать меньшее число полей зрения (30—70 в зависимости от увеличения).

Независимо от метода окраски бактериоскопическое иссле­дование позволяет обнаружить бактерии при их концентрации не менее 5000—10 000 в 1 мл образца, поэтому отрицательный результат не позволяет исключить заболевание.

Микроскопическое исследование является ориентировоч­ным и дает возможность судить лишь о наличии в материале кислотоустойчивых бактерий без определения их видовой при­надлежности. Метод не позволяет дифференцировать микобак-терии между собой и от других кислотоустойчивых микроор­ганизмов. Легочные и внелегочные поражения в первую оче­редь у лиц с иммунодефицитом различной этиологии могут быть вызваны не только бактериями комплекса Mycobacterium tuberculosis (МТС), но также и нетуберкулезными микобакте-риями: бактериями комплекса М.avium (MAC), M.kansassii, реже другими представителями рода Mycobacterium. Посколь­ку нетуберкулезные микобактерии являются обитателями ок­ружающей среды, загрязняющими воду, продукты, системы принудительной вентиляции/кондиционирования воздуха и др., они могут также присутствовать в образце как контами-нанты.

Бактериоскопическое исследование считается оптимальным методом ориентировочной экспресс-диагностики туберкулеза.

Бактериологическое исследование.Считается ведущим мето­дом диагностики туберкулеза, поскольку обладает достаточно высокой чувствительностью, специфичностью и обеспечивает материал (чистую культуру), необходимый для определения чувствительности возбудителя к противомикробным препара­там.

Для выделения чистой культуры микобактерии производят посев исследуемого материала на специальные жидкие или плотные питательные среды. Для выделения микобактерии из нестерильного материала желательно использовать селектив­ные среды, содержащие антимикробные препараты, подавляю­щие рост посторонних микробов. Для культивирования мико­бактерии применяют плотные яичные (среда Левенштейна— Йенсена) и агаровые среды, а также ряд синтетических жидких питательных сред.

Среда Левенштейна—Йенсена готовится из суспензии све­жих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, КН2РО4, суль­фата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85 °С в течение 45 мин.

Большинство питательных сред выпускаются микробиоло­гической промышленностью в виде полуфабрикатов или в го­товом виде. Поскольку на жидких средах скорость роста ми­кобактерии выше, чем на плотных, для ускорения исследова­ния рекомендуется осуществлять посев одновременно на плотную и жидкую среду. Посевы необходимо инкубировать в атмосфере с повышенным содержанием С0₂ (5—10 %). Мини­мальный срок инкубации составляет не менее 8 нед. Посевы первый раз просматривают на 3—5-й день после внесения материала, далее — 2 раза в неделю. Начиная с 5-й недели

культивирования — 1 раз в неделю. Культуры М.tuberculosis имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 14.3.1; на вклейке). Еще до появления видимых невооруженным глазом макроско­пических колоний на плотных средах с помощью микроскопии могут быть обнаружены микроколонии. Отсутствие микробно­го роста через 8 нед культивирования следует расценивать как отрицательный результат.

В последнее время широкое применение нашли также раз­личные коммерческие системы культивирования микобакте­рии, использующие как жидкие, так и плотные питательные среды, а также различные высокочувствительные способы ав­томатизированного контроля роста бактерий на основании их метаболической активности — по потреблению компонентов питательной среды и/или образованию продуктов жизнедея­тельности. Это позволяет обнаружить присутствие бактерий значительно раньше появления видимых признаков роста. Для посева используют стандартные емкости, заполненные готовой средой. Определение концентрации соответствующего метабо­лита в каждой пробе осуществляется непрерывно с помощью радиометрических, флюорометрических, колориметрических, манометрических или других методов в специальной камере для инкубации посевов, регистрируется и анализируется с по­мощью компьютера. В настоящее время изотопные методы контроля роста вытесняются неизотопными, основанными на различных способах детекции поглощения и выделения газов (0₂ и/или С0₂) микроорганизмами в ходе активного метабо­лизма. Использование указанных методов контроля роста по­зволяет в большинстве случаев существенно ускорить процесс выделения чистой культуры микобактерии. Положительный результат может быть получен уже через 3—5 дней, средний срок составляет 7—14 дней. Однако, учитывая вероятную низ­кую концентрацию возбудителя в исследуемом материале, мак­симальный срок инкубации достаточно велик — результат бак­териологического исследования считается отрицательным при отсутствии признаков роста в течение 40 дней. В случае регистрации положительного результата культивирование про­должают до тех пор, когда количество бактерий в среде дости­гает определенной концентрации, необходимой для проведе­ния дальнейшего изучения выделенной чистой культуры — идентификации и определения чувствительности к антимик­робным препаратам. Среднее время культивирования состав­ляет 9—20 дней.

Бактериологический метод дает положительный результат при наличии не менее 10—30 жизнеспособных микобактерии в 1 мл исследуемого материала после обогащения. Чувствитель­ность бактериологического метода приближается к 100 %, од­нако не всегда позволяет однозначно исключить заболевание.

Отрицательный результат в ряде случаев может быть обуслов­лен очень низким содержанием возбудителя в клиническом образце.

Идентификация чистой культуры. Выделенные чис­тые культуры микобактерий обычно идентифицируют до вида. Идентификация осуществляется с помощью традиционных ме­тодов (на основании фенотипических признаков бактерий — культуральных и биохимических), а также с использованием молекулярно-генетических и химических методов анализа вы­деленной культуры.

Традиционные методы идентификации основаны на изуче­нии достаточно большого числа признаков, включая скорость роста, морфологию колоний, способность к пигментообразо-ванию, продукции никотиновой кислоты, восстановлению нит­ратов и теллурита калия, гидролизу твина-80, мочевины (уре-азная активность), пиразинамида до пиразиновой кислоты (пиразинамидазная активность), перекиси водорода при повы­шенной температуре (термоустойчивая каталазная активность) и некоторых других. На основании этих признаков можно однозначно идентифицировать представителей основных ви­дов Mycobacterium spp., вызывающих заболевания человека. Процедура идентификации по фенотипическим признакам может занимать до 3 нед. Специфичность метода составляет 100%.

Способность исследуемой культуры синтезировать никоти­новую кислоту (ниациновая проба Конно) является одним из важных признаков, с помощью которого удается отличить М.tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от M.bovis, образующих ее в минимальных количествах. Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой пи­тательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирки добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

При выращивании микобактерий на предметных стеклах (метод микрокультур Прайса) вирулентные штаммы характе­ризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора (рис. 14.3.2; на вклейке). На нескольких пред­метных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабаты­вают несколько минут 2—6 % серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цит-ратной кровью в разведении 1:4—1:8 и ставят в термостат. Через 7—14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, ок­рашивают по методу Циля—Нильсена и микроскопируют.

Идентификация микобактерий методом гибри­дизации ДНК ("ДНК-зонд о в"). Метод гибридизации ДНК применяют для быстрой идентификации чистой культуры

микобактерий. Использование ДНК-зондов позволяет полу­чить окончательный ответ в течение суток после завершения культивирования и, таким образом, существенно сокращает общий срок исследования. На сегодня существуют ДНК-зонды для идентификации только наиболее клинически значимых и широко распространенных микобактерий, вызывающих забо­левания человека: комплекса M.tuberculosis, комплекса М.avium и M.kansassii. Таким образом, метод позволяет надежно иден­тифицировать представителей указанных видов и дифференци­ровать их от других патогенных микобактерий, а также от непатогенных сапрофитов, загрязняющих клинические образ­цы. Метод основан на гибридизации материала из чистой куль­туры с меченым ДНК-зондом, комплементарным видоспеци-фическим последовательностям в составе рРНК бактерий. Об­разовавшиеся в результате гибридизации ДНК-РНК-комплек­сы выявляют по наличию метки. Обычно используют флюоре­сцентную метку, присутствие которой легко обнаружить с по­мощью флюориметрии. Для надежной идентификации требу­ется не менее 10⁵ бактерий. При этом чувствительность и специфичность метода составляют 100 %.

При высоком содержании возбудителя в клиническом об­разце использование коммерческих систем культивирования в сочетании с гибридизацией ДНК позволяет получить оконча­тельный результат бактериологического исследования уже на 4—7-й день.

Идентификация микобактерий по липидному со­ставу (хе моидентификация). Анализ количественного и качественного состава липидов клеточной стенки микобакте­рий (миколовых кислот) осуществляют с помощью газожид­костной или жидкостной хроматографии. Метод позволяет осу­ществить идентификацию любого из известных 50 видов ми­кобактерий в течение 4 ч. Основными факторами, ограни­чивающими его широкое применение, являются необходимость использования дорогостоящего оборудования и техническая сложность интерпретации результатов.

Определение чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Является обязательным эта­пом микробиологической диагностики туберкулеза и основой назначения адекватной этиотропной терапии. Традиционно опре­деление чувствительности микобактерий осуществляют методом серийных разведений препарата в питательной среде. Наиболее надежным считается использование плотных питательных сред с последующим подсчетом числа выросших колоний. Иссле­дование может занимать более 3 нед (до 3 мес), что обуслов­лено чрезвычайно низкой скоростью роста резистентных вари­антов. Клинические границы устойчивости M.tuberculosis (МПК): стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК — 10 мкг/мл, туба-зид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл. Бакте-

рии считают резистентными в том случае, если более 1 % клеток чистой культуры сохраняет способность к образованию коло­ний в присутствии указанной концентрации препарата.

Применение современных методов контроля роста бактерий (см. выше) позволило существенно сократить срок исследова­ния (до 7—14 дней). Однако следует учитывать, что определе­ние жизнеспособности бактерий в присутствии антибиотика по интенсивности их метаболической активности не всегда позво­ляет надежно дифференцировать чувствительную культуру от смешанной, содержащей 1—10 % резистентных бактерий. В на­стоящее время осуществляется интенсивная разработка более надежных методов контроля жизнеспособности, основанных на прямом подсчете числа живых бактерий с использованием проточной цитофлюориметрии, позволяющих избежать подоб­ных ошибок.

Молекулярно-генетические методы определения чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам. Методы ПЦР-диагностики позволяют обнару­жить наличие у возбудителя генов, контролирующих резис­тентность к определенному препарату. Уже разработаны тест-системы на основе ПЦР для определения резистентности к препаратам группы рифампицинов.

Биопроба.Ранее для диагностики туберкулеза применяли биопробу: чистую культуру М.tuberculosis выделяли из органов животного, зараженного исследуемым материалом. Исследуе­мый материал обрабатывают серной кислотой для освобожде­ния от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят под­кожно в количестве 2—3 мл морской свинке и кролику с отрицательными туберкулиновыми реакциями. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. Ме­тод также применяется для определения вирулентности мико­бактерий. М.tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и малопатогенны для кроликов. M.bovis высокопатогенны для кроликов. В настоящее время метод практически не применя­ется.

Экспресс-методы диагностики.Биохимические и молеку-лярно-биологические исследования. Исследуемый мате­риал, полученный из очага инфекции, используют для обнару­жения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. Метод позволяет обнаружить наличие видоспецифических нуклеиновых кислот микобактерий непосредственно в клиническом образце после обогащения. Исследование занимает около 4 ч. Существующие коммерческие тест-системы позволяют выявить в образце (мокроте, плевральном экссудате, пунктате лимфатических уз­лов и др.) присутствие МТС — бактерий комплекса M.tubercu-losis (M.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) и надежно диф­ференцировать их от нетуберкулезных микобактерий. Послед-

нее имеет принципиальное значение для раннего эмпиричес­кого назначения этиотропной терапии, поскольку нетуберку­лезные микобактерий, включая MAC, существенно отлича­ются от МТС по чувствительности к антимикробным пре­паратам.

Чувствительность метода приближается к 100 % только для образцов, в которых микобактерий были обнаружены бакте-риоскопическим методом, в других случаях она не превышает 90 %. Нельзя также исключить вероятность ложноположитель-ных результатов. Специфичность ПЦРпо различным оценкам составляет 70—100 %. Таким образом, по чувствительности ме­тод ПЦРсопоставим с бактериологическим исследованием, однако позволяет получить результат в течение 24 ч от момента получения материала.

Результаты ПЦР-диагностики рекомендуется интерпретиро­вать в зависимости от данных бактериоскопического исследо­вания. Получение положительного ответа бактериоскопичес-ким методом и ПЦР позволяет диагностировать туберкулез и рекомендовать немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по классической схеме. Отрицательный результат ПЦР при наличии кислотоустойчивых микобактерий в мазках позволяет исключить присутствие МТС и рекомендовать на­значение антимикробных препаратов, активных в отношении нетуберкулезных микобактерий. В других ситуациях рекомен­дуется ожидать результатов бактериологического исследова­ния.

Серодиагностика.Антитела к антигенам возбудителя в крови пациентов можно обнаружить с помощью РСК, РНГА и других серологических реакций. Необходимо иметь в виду, что поло­жительные результаты отмечаются не только при активном туберкулезном процессе в организме, но также при инфици­ровании М.tuberculosis и вакцинации, поэтому существенного диагностического значения не имеют.

Кожно-аллергаческая проба.Ставится с туберкулином — очи­щенной белковой фракцией, полученной из фильтрата бульон­ной культуры М.tuberculosis. Используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакци­нации и отбора контингентов для ревакцинации против тубер­кулеза. Туберкулин вводят внутрикожно в строго определенной дозировке (реакция Манту). Результаты (появление гиперемии и образование папулы в положительном случае) учитывают через 24—48 ч (см. рис. 10.4.1).