Методика визначення активності СОД.

Принцип методу: адреналін здатний до реакції автоокиснення у лужному середовищі з генерацією супероксиданіонрадикалу, причому ця реакція протікає з певною швидкістю (V₁). У присутності СОД ця швидкість зменшується до деякого значення (V₂), що залежить від активності СОД. Порівняння швидкостей V₁ та V₂, дає змогу судити про активність СОД у дослідному зразку біоматеріалу.

Хід визначення:0,5 г серця гомогенізувати на холоді у фарфоровій ступці з піском з додаванням 4,5 мл води. Відібрати 1 мл гомогенату та додати 2 мл суміші для осадження гемоглобіну (етанол : хлороформ = 5 : 3 за об’ємом), добре перемішуючи скляною паличкою. Пробірки закрити гумовими пробками та поставити у холодильник, де видержати при температурі –4°С не менше доби. За добу проби добре розмішувати скляною паличкою та центрифугувати при 3000 об/хв. протягом 15 хв. Визначити швидкість автоокиснення адреналіну за участю лужного буферного розчину та розчину адреналіну, який перетворювався у червоно-жовтий адренохром.

Приготування буферної суміші рН 10,2: у мірну колбу місткістю 1000 мл вносили 4,5 г безводного гідрокарбонату натрію та розчинити його у невеликій кількості дистильованої води, 3,52 г карбонату натрію зневодненого (або 9,5 г карбонату натрію десятиводного), потім перемішати та долити дистильовану воду майже до мітки на мірній колбі. Перевірити рН суміші - у разі необхідності довести рН до значення 10,2, додаючи обережно невеликими порціями гідрокарбонат натрію, якщо рН більше 10,2, або карбонат натрію, якщо рН менше 10,2. Суміш зберігати у холодильнику у склянці з притертою пробкою при температурі +8-+10°С протягом 2-х тижнів. Робочий розчин адреналіну приготувати таким чином: 0,192 г лимонної кислоти розчинити у 50 мл води, додати 0,333 г адреналіну гідротартрату, довести водою до 100 мл та зберігати у холодильнику.

Контроль: у кювету КФК-2 з довжиною оптичного шляху 10 мм налити 4,4 мл буферної суміші, 0,1 мл дистильованої води, встановити цю кювету у кюветоутримувач колориметра фотоелектричного КФК. Виставити на приладі „0” оптичної густини. Буферний розчин під час дослідження повинен знаходитися у термостаті при температурі 26°С. Після цього додати 0,5 мл робочого розчину адреналіну, та включити секундомір. Розчин перемішати пластиковою паличкою та виміряти оптичну густину його через кожну хвилину терміном всього часу, коли спостерігається її зростання. Для дослідної проби провести слідуючий порядок: у кювету налити 4,4 мл буферної суміші, 0,1 мл проби, взятої з верхнього шару центрифугата, встановити цю кювету у кюветоутримувач КФК, далі діяти за попереднім ходом роботи.

Активність супероксиддисмутази обчислити за формулою:

(2.2)

де: Т – процент гальмування реакції автоокиснення адреналіну, %;

ΔE_к/t – найбільша швидкість автоокиснення адреналіну;

ΔE_д/t – найбільша швидкість автоокиснення адреналіну у присутності проби, що містить супероксиддисмутазу.

Потім слід вичислити долю гальмування:

, (2.3)

де: А_с – активність супероксиддисмутази в умовних одиницях.

Примітка. Одиниця вказує на гальмування швидкості реакції на 50%.

Контрольні питання:

1. АОЗ клітин.

2. Вказати і охарактеризувати ендогенні сполуки.

3. Антиоксидантний захист звязуванням іонів металів.

1. Класифікація антигіпоксантів.

2. Характеристика синтетичних препаратів.

3. АОЗ тканин.

1. Класифікація АО.

2. Склад і функції СОД.

3. Низькомолекулярні біоантиоксиданти, які синтезуються в організмі людини.

Тестові завдання:

1. Ліпофільним АО є:

а.) ретинол;

б.) фенол;

в.) тіол.

2. Комплекси АО, що використовують фармакологічно:

а.) мелатонін;

б.) ебселен;

В.) тріовіт, аскорутин.

3. Синтетичні АО:

а.) токоферол;

б.) тіол;

В.) феноксан.

4. СОД – це:

а.) реактант гострої фази, що має один поліпептидний ланцюг;

б.) головний продуцент Н₂О₂ в клітині;

в.) фермент, що дисмутує пероксид водню в воду і триплетний кисень.

5. У прокаріот СОД містить:

а.) залізо і марганець;

б.) мідь і цинк;

в.) залізо і цинк.

6. АО, що забезпечує захист токоферола або відновлює його окислену форму після атаки вільних радикалів:

а.) аскорбінова кислота;

б.) ретинол;

в.) убіхінон.

7. АО,що здатен зв’язувати АФК з утворенням стабільного феноксильного радикалу:

а.) іонол;

б.) фенбутол;

в.) оліфен.

8. АО,що здатен відновлювати функції ендотелію у хворих на ішемію серця:

а.) оліфен;

б.) іонол;

В.) пробукол.

9. АО фермент, що активує глутатіонпероксидазу:

а.) селеніт натрію;

б.) орготеїн;

в.) ерісод.

10. До блокаторів утворення вільних радикалів відносять:

а.) убіхінон;

б.) аллопурінол;

в.) ерісод.

Література:

1. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. Мир, Москва, 2000, 469 с.
2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х томах. Т.2. Мир, Москва, 1985, 368 с.
3. Страер Л.С. Биохимия: Пер. с англ. В 3-х томах. Т.1. Мир, Москва,1984, 1232 с.
4. Уайт Л., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: в 3-х томах.

Лабораторна робота №4