Основний дослід реакції зв‘язування комплементу (РЗК) з метою серологічної діагностики кашлюку»
Компонети РЗК:
1. Сироватка крові дослідної людини Дослідна система
2. Специфічний антиген
3. Комплемент
4. Еритроцити барана Індикаторна (гемолітична) система
5. Гемолітична сироватка
Принцип РЗК:
Реакція проходить у дві фази. Перша фаза - взаємодія антигену і антитіл за обов'язкової участі комплементу. Друга - виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка). Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо ж комплемент адсорбував раніше на комплексі антиген-антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає.
Результат досліду оцінюють, відзначаючи наявність або відсутність гемолізу в усіх пробірках. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безбарвна, і еритроцити осідають на дно, негативною - при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова» кров). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності забарвлення рідини і величини осаду еритроцитів на дні (++++, + + +, + +, +).
Порядок поставлення демонстраційного досліду РЗК:
1. Реакцію проводити в 3 пробірках. Відтитровані інгредієнти (антиген, комплемент, гемолітичну сироватку) розвели фізрозчином таким чином, щоб робоча доза їх містилася в 0,5 мл.
2. Одночасно приготували 3% суспензію овечих еритроцитів. У додатковому ряді пробірок розвели інактивовану прогріванням (560С – 30 хвилин) досліджувану сироватку.
3. При проведенні реакції спочатку змішали досліджувану сироватку, антиген і комплемент.
4. Суміш витримали при температурі 370С впродож 40 хвилин.
5. Після зазначеного терміну в пробірку додали сенсибілізовану гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів).
6. Пробірки знову струснули і помістили у термостат при 370С.
Зробіть облік демонстраційної РЗК з метою серологічної діагностики кашлюку, результати досліду та висновок занесіть до таблиці.
| Фази реакції | Інгредієнти, що беруть участь у реакції | Номера пробірок | ||
| 1 - дослід | 2 – контроль сироватки | 3 – контроль антигену | ||
| 1. | 1.Дослідна сироватка, мл | 0,5 | 0,5 | - |
| 2.Кашлюковий антиген у робочій дозі, мл | 0,5 | - | 0,5 | |
| 3.Комплемент у робочій дозі, мл | 0,5 | 0,5 | 0,5 | |
| 4.Ізотонічний розчин, мл | - | 0,5 | 0,5 | |
| Інкубація у термостаті 370С впродовж 30 хвилин | ||||
| 2. | 5.Гемолітична система, мл | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Інкубація у термостаті 370С впродовж 30 хвилин | ||||
| Облік результатів: | ||||
| Рисунок: | ||||
| Висновок | __________________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ ___________________________________________________ |
Пряма реакція імунофлуоресценції, з метою діагностики холери.
Компоненти РІФ:
1. Дослідний матеріал від хворої людини (наприклад, для діагностики холери - випорожнення).
2. Люмінесцентна специфічна сироватка (наприклад, для діагностики холери – холерна люмінесцентна сироватка).
Принцип РІФ:
Імунофлюоресцентний метод є методом вибору для швидкого виявлення та ідентифікації невідомого мікроорганізму в досліджуваному матеріалі.
Аг (з матеріалу) + АТ (з сироватки, міченої флуорохромами) + електроліт = комплекс світиться в УФ-променях.
Для РІФ, часто використовують барвник ізотіоціонат флюоресцеїну – ФІТЦ.
При дослідженні цим методом використовують люмінесцентний мікроскоп.
Постановка РІФ:
· На мазок наносять 30 мкл розчину ФІТЦ мічених антитіл.
· Поміщають скло у вологу камеру і витримують при кімнатній температурі впродовж 20-25 хв. або в термостаті при 37°С впродовж 15 хв.
· Промивають скло у проточній водопровідній воді 2 хв, обполіскують дистильованою водою і висушують на повітрі.
· На висушений мазок наносять краплю рідини вмонтовуючи, мазок накривають покривним склом і мікроскопують з використанням люмінесцентного мікроскопа або люмінесцентної насадки до звичайного оптичного мікроскопу.
Зробіть облік демонстраційної РІФ з метою експрес-діагностики холери, результати досліду та висновок занести до таблиці.