Визначення вмісту вторинних продуктів перекисного окиснення біополімерів

Лабораторна робота №1

Тема: Визначення величин показників, що характеризують прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз

Мета: ознайомитись з процесами перекисного окиснення ліпідів, визначити вміст первинних продуктів перекисного окиснення біополімерів.

Основні поняття: ненасичені жирні кислоти (НЖК), фосфоліпіди, продукти перекисного окиснення, кисневі радикали, омега – 3 жирні кислоти, ейкозаноїди

Питання для теоретичної підготовки:

1. НЖК (будова, біологічне значення)
2. Місця протікання перекисного окиснення. Шляхи перекисного окиснення.
3. Продукти ПО
4. Фізіологічна роль перекисного окиснення НЖК
5. Роль омега-3 жирних кислот.
6. Біологічні ефекти продуктів перекисного окиснення жирних кислот.

Хід роботи:

Розглянути та замалювати схему:

Контрольні питання:

1. Дати визначення поняттям «ненасичені жирні кислоти», «кисневі радикали»
2. Описати основні шляхи окислення жирних кислот.
3. Роль омега-3-жирних кислот.

1. Продукти перекисного окиснення.

2. Роль перекисного окиснення НЖК в організмі.

3. Дати визначення поняттям «омега-3-жирні кислоти», «ейкозаноїди»

Література:

1. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия: Пер. с нем. Мир, Москва, 2000, 469 с.
2. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х томах. Т.2. Мир, Москва, 1985, 368 с.
3. Страер Л.С. Биохимия: Пер. с англ. В 3-х томах. Т.1. Мир, Москва,1984, 1232 с.
4. Уайт Л., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: в 3-х томах.

Лабораторна робота № 2

Визначення вмісту вторинних продуктів перекисного окиснення біополімерів

Мета:визначити величини показників, що характеризують прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз. Визначити вміст ТБК-реагуючих продуктів (МДА).

Основні поняття:малоновий діальдегід, екстинкція, максимум поглинання, супернатант, тіобарбітурова кислота, вільнорадикальна патологія, антиоксидантний статус організму

Питання для теоретичної підготовки:

1. Місця протікання перекисного окиснення. Шляхи перекисного окиснення.

2 .Біологічні ефекти продуктів перекисного окиснення жирних кислот.

Хід роботи:

У серці тварин визначали вміст вторинних продуктів перекисного окиснення біополімерів, здебільшого ліпідів, за приростом концентрації малонового діальдегіду (МДА) у спонтанних умовах, а також після інкубації гомогенату серця у залізоаскорбінатному буферному розчині (прооксидантна ситуація з аскорбатзалежною пероксидацію) або у буферному розчині, що містить НАДФН (ферментативна пероксидація). МДА визначали за реакцією з 2-тіобарбітуровою кислотою (2-ТБК) у кислому середовищі до (МДА-0) та після 1,5-годинної інкубації (МДА-1,5) гомогенату серця у прооксидантному залізоаскорбатному буферному розчині, з подальшим розрахунком приросту за час інкубації (ΔМДА).

Принцип методу: при нагріванні розчину альдегідів з 2-ТБК у кислому середовищі утворюється триметиновий комплекс помаранчевого кольору з максимумом поглинання при 532 нм, молярний коефіцієнт екстинкції якого 156000 .

Хід визначення: 0,5 г серця гомогенізували на холоді у 4,5 мл води. Відбирали 0,5 мл гомогенату та додавали 4,5 мл прооксидантного буферного розчину. Буферний розчин готували так: у мірну колбу місткістю 1000 мл, вносили 500 мл дистильованої води, додавали 1,9 г трис-(окси)-метиламінометану, 50 мл 0,1 н розчину соляної кислоти, 1,4 г аскорбінової кислоти, 0,032 г заліза сірчанокислого семиводного. Реактиви вносили тільки у вказаному порядку, при цьому наступний реактив додавали лише після повного розчинення попереднього. Доливали дистильовану воду майже до мітки на мірній колбі, добре перемішували та залишали суміш у темряві на 1 добу. За цей час колір суміші повинен змінитися з синьо-фіолетового на жовтий. Через добу перевіряли рН суміші та у разі необхідності доводили рН до значення 7,4, обережно невеликими порціями додаючи розчин трис-(окси)-метиламінометану, якщо рН менше 7,4, або розчин соляної кислоти, якщо рН більше 7,4. Відбирали по 2 мл суміші у дві пробірки, одну пробірку ставили у термостат на інкубацію при температурі 37°С протягом 1,5 години. У іншу пробірку що залишилася, додавали 1 мл 30% розчину трихлороцтової кислоти (ТХО), перемішували скляною паличкою та центрифугували при 3000 об/хв. термін 30 хв. Теж саме робили після інкубації. У штатив для пробірок набирали два ряди хімічних пробірок. Кількість пробірок у кожному ряду дорівнювала кількості проб, що аналізуються; крім того, у штатив ставилася ще одна пробірка для контролю на реактиви. Пробірки першого ряду підписували номером проби, другого – номером проби зі штрихом. Відбирали по 2 мл супернатанту та переносили його у хімічну пробірку, позначену відповідним номером. У хімічні пробірки для контролю на реактиви наливали 1,2 мл буферної суміші, 0,7 мл розчину ТХО та 0,1 мл дистильованої води. У всі хімічні пробірки наливали 3 мл розчину ТБК, добре перемішували та переносили їх у круглий металевий штатив. Штатив з пробірками ставили на водяну баню та витримували при температурі кипіння води терміном 50 хв. Пробірки охолоджували водопровідною водою та вимірювали оптичну густину розчинів, що знаходяться у них, на КФК-2 у кюветі з довжиною оптичного шляху 10 мм при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) проти контролю на реактиви. Концентрацію ТБК-активних продуктів у еритроцитах крові обчислювали за формулою:

де: С_МДА – концентрація ТБК-активних продуктів, мкМ;

240,4 – коефіцієнт, що враховує молярний коефіцієнт поглинання розчину, об’єм взятої для аналізу проби, розведення проби у ході аналізу, довжину оптичного шляху;

Е – екстинкція проби

Контрольні питання:

1. Малоновий діальдегід (будова, реакції в організмі)

2. Чому експеримент з ТБК-реагуючими речовинами проводять з серцевим м’язом?

3. Дати визначення поняттю «вільнорадикальна патологія»

1. В чому полягає суть реакції МДА з ТБК?

2. Які речовини належать до вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів?

3. Дати визначення поняттю «антиоксидантний статус організму»

Тестові питання:

1 Малоновий діальдегід по суті є:

а) альдегідом з формулою СН ОН

б) фенолом з формулою С Н ОН

в) альдегідом з формулою СН (СНО)

г) фенолом з формулою R¹R²C=CR³OH

2. Малоновий ліальдегід слугує маркером:

А) пероксидації жирів

б) антиоксидантного статусу організму

В) окислювального стресу

г) роботи печінки

3. На чому засновано реакцію МДА з ТБК:

а) взаємодії з вивільненням енергії (нагріванням)