Тема: Микробиологическая диагностика кандидозов.

Пед.ф-т, 2006

ЗАНЯТИЕ 28

Цель: На основе знаний биологии дрожжеподобных грибов рода Candida, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Классификацию и морфобиологические особенности дрожжеподобных грибов рода Candida.

2. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при заболеваниях, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.

3. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.

4. Профилактику и терапию заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.

Уметь:

1. Микроскопировать препараты из исследуемого материала для изучения дрожжеподобных грибов рода Candida и интерпретировать полученные результаты.

2. Учитывать, оценивать и интерпретировать результаты посева на хромогенные среды исследуемого материала при диагностике заболеваний, вызываемых дрожжеподобными грибами рода Candida.

3. Учитывать и оценивать результаты определения чувствительности дрожжеподобных грибов рода Candida к антимикотикам с помощьюFUNGITEST.

Контрольные вопросы:

1. Виды дрожжеподобных грибов рода Candida, играющие роль в патологии человека.

2. Морфобиологические особенности C.albicans как основного возбудителя заболеваний кандидозной этиологии.

3. Особенности экологии, эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при заболеваниях, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.

4. Заболевания, вызываемые дрожжеподобными грибами рода Candida, у детей.

5. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.

6. Интерпретация результатов при микроскопическом и микологическом исследованиях с целью диагностики заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.

7. Профилактика и терапия заболеваний, вызываемыхдрожжеподобными грибами рода Candida.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести микологическое исследование беременной (III триместр) с клиническим диагнозом «Кандидозный вульвовагинит»:

1.1. Ознакомиться с транспортной средой, тампонами для взятия и транспортировки материала.

1.2. Промикроскопировать препарат из влагалища (окраска по Граму) и оценить полученный результат.

1.3. Изучить посев исследуемого материала на среду Candi-select:

- подсчитать количество характерных колоний;

- приготовить фиксированный препарат из изолированной колонии, окрасить по Граму, промикроскопировать.

1.4. Ознакомиться с тест-системойAUXACOLORдля биохимической идентификации дрожжеподобных грибов. В случае необходимости учесть и оценить результаты.

1.5. Учесть и оценить результаты определения чувствительности исследуемой культуры к противогрибковым препаратам с помощью микропанели FUNGITEST.

На основании полученных результатов сделать вывод о видовой принадлежности исследуемой культуры, ее чувствительности к противогрибковым препаратам и диагностической значимости полученных результатов. Заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

2. Описать биопрепараты: кандидозный антиген для РСК, кандидозный аллерген.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите микологическое исследование беременной (III триместр) с клиническим диагнозом «Кандидозный вульвовагинит»

Первичное инфицирование новорожденных происходит в родовых путях, чему способствует увеличение частоты носительства дрожжеподобных грибов рода Candida на слизистой оболочке влагалища женщин в конце беременности. Дрожжеподобные грибы рода Candida выявляют в 10-20% случаев у здоровых небеременных женщин, у беременных – в 25-33% случаев, а при угрозе прерывания беременности – у 65-75% женщин. Поэтому большое значение имеет микробиологическое обследование беременных с целью предупреждения инфицирования новорожденных.

1 этап. Материал из влагалища забирают после введения гинекологического зеркала стерильным ватным тампоном с задней стенки или с патологически измененных участков. Тампон помещают в пробирку с транспортной средой (Стюарта и др.).

Помимо взятия материала на посев врач-гинеколог или специально обученная медсестра готовит мазки для микроскопии, используя отдельные стерильные тампоны. Материал равномерно распределяют на предметном стекле мягкими движениями, избегая грубого втирания и резких штриховых движений.

Стекла и пробирки с исследуемым материалом доставляют в баклабораторию. Стекла окрашивают по Граму, а материал из влагалища засевают методом «штрих с площадкой» на ½ чашки Петри с соответствующей питательной средой (Candi-select и др.)

Доказательством этиологической роли грибов рода Candida при микроскопическом исследовании является выявление в исследуемом материале многочисленных клеток округлой и овальной формы и псевдомицелия; последний отличается от истинного мицелия отсутствием общей оболочки и перегородок и состоит из длинных клеток, соприкасающихся друг с другом узким основанием. Псевдомицелий является патогенетической формой грибов рода Candida. Обнаружение единичных, округлых или овальных клеток при микроскопическом исследовании материала из открытых очагов поражения не имеет диагностического значения.

2 этап.Изучите результаты посева исследуемого материала на среде Candi-select: подсчитайте количество характерных колоний,приготовьте фиксированный препарат из изолированной колонии, окрасьте по Граму, промикроскопируйте.

Для уменьшения времени исследования в микробиологической практике используют хромогенные среды, которые позволяют сочетать получение культуры с ее идентификацией. При этом время на собственно идентификацию вообще не тратится. При микробиологической диагностике кандидозов такой средой является Candi-select (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur). Это селективная среда, содержащая питательную основу для роста грибов, хромогенный субстрат для определения N-ацетил b-D-галактозамидазы C. albicans и два антибиотика, хлорамфеникол и гентамицин, которые подавляют рост бактериальной микрофлоры. Идентификация C. albicans, основного клинически значимого вида среди дрожжеподобных грибов, основана на выявлении ее специфического фермента N-ацетил b-D-галактозамидазы, который гидролизуя хромогенный субстрат, приводит к окрашиванию колоний в голубой цвет. В мазке C. albicans имеет вид округлых или овальных, одиночных и почкующихся клеток, окрашенных по Граму в фиолетовый цвет. Учет результатов осуществляется через 24-48 ч.

В том случае, если вырастают колонии белого цвета, то проводят идентификацию с помощью тест-системы AUXACOLOR (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur) (см. приложение 1).

Так как C. albicans относится к условно-патогенным микроорганизмам и выявляется в составе нормальной микрофлоры слизистых оболочек половых органов, в оценке результатов микологического исследования диагностическое значение имеет их количество. Диагностически значимым является также выделение C. albicans при повторном исследовании.

Для количественной оценки результатов, полученных при штриховом посеве тампоном на ½ чашки используют следующие критерии:

- степень 1 – очень скудный рост (на плотных питательных средах роста нет, рост только в жидкой питательной среде);

- степень 2 – небольшое количество – 1-10 колоний;

- степень 3 – умеренное количество – 11-100 колоний;

- степень 4 – большое количество – более 100 колоний.

Результат, соответствующий 1 и 2 степени, свидетельствует о контаминации исследуемого материала нормальной микрофлорой; 3-4 степени – об этиологической роли выделенного микроорганизма (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.1985).

3 этап.Учтите и оцените результаты определения чувствительности исследуемой культуры к противогрибковым препаратам с помощью микропанели FUNGITEST.

В числе новых методов определения чувствительности грибов рода Candida к противогрибковым препаратам является использование тест-системы FUNGITEST (Bio-Rad, Sanofi Diagnosticts Pasteur).

FUNGITEST используется для определения чувствительности грибов к 6 противогрибковым препаратам в 2-х различных концентрациях на специальной питательной среде, содержащей индикатор, который, в случае роста грибов, меняет цвет с голубого на красный. Когда рост грибов задерживается за счет противогрибковых препаратов, среда остается синей.

Микропанель состоит из 16 микролунок, содержащих:

- Т⁺ - положительный контроль роста;

- Т^- - отрицательный контроль роста;

- лунки с 6-ю противогрибковыми препаратами в 2-х различных концентрациях.

Учет и оценка результатов осуществляется через 48 ч культивирования при 37°С; наличие 2-х концентраций противогрибковых препаратов позволяет получить профиль чувствительности тестируемых грибов (чувствительная, умеренно устойчивая, устойчивая).

Критерием достоверности полученных результатов является наличие роста и изменение цвета индикатора с голубого на красный в лунках Т⁺ и отсутствие роста и изменение цвета индикатора в лунках Т^-.

Примеры:

AB 2 AB 8 синяя /синяя чувствительная

KET 0,5 KET 4 красная /красная устойчивая