РАБОТА № 1. КОЛОРИМЕТРИЯ, ОБЩИЙ ПРИНЦИП. УСТРОЙСТВО ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРА

Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямо пропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщины кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, l).

Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра

Расчет концентрации вещества

1) по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества);

где С_о – концентрация опытной пробы;

Е_о – экстинкция опытной пробы;

С_ст - концентрация стандартной пробы;

Е_ст - экстинкция пробы со стандартным раствором.

2) по калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 2

РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Обоснование выполнения работы. Цветные реакции на белки и аминокислоты позволяют обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, установить аминокислотный состав. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белков и аминокислот.

1. Биуретовая реакция на белки

Принцип метода. Раствор белка в щелочной среде в присутствии сульфата меди (NaOH/CuSO₄) окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексного соединения ионов меди с пептидными группами белка, которых должно быть не менее двух. Таким образом, эта реакция открывает все белки, а также низкомолекулярные пептиды.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка NaOH, 10 % CuSO4, 1 %	5 капель 5 капель 2 капли

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

2. Нингидриновая реакция

Принцип метода: аминокислоты, пептиды и белки при кипячении с раствором нингидрина дают синее окрашивание (комплекс Руэмана). Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении.

СО₂

АМИНОКИСЛОТА + НИНГИДРИН ® ШИФФОВО ОСНОВАНИЕ

АЛЬДЕГИД

АМИНОДИКЕТОГИДРИНДЕН + НИНГИДРИН КОМПЛЕКС РУЭМАНА (СИНЕ-ФИОЛЕТОВОГО ЦВЕТА)

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка Нингидрин 0,5 %	5 капель 5 капель
Кипятить до появления окраски

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

1. Ксантопротеиновая реакция Мульдера

(на ароматические аминокислоты)

NO₂

t° 100°C

HO― ―CH₂―CH―COOH + 2HNO₃ →HO― CH₂―CH―COOH

│ │

NH₂ NO₂ NH₂

тирозин динитротирозин

Принцип метода. Ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) при нагревании с азотной кислотой нитруются. Это проявляется развитием желтого окрашивания.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
раствор белка   HNO3 концентрированная	5 капель 5 капель
Кипятить до появления окраски

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

4. Реакция Фоля на цистеин

Принцип метода. Реакция характерна для слабосвязанной серы в составе аминокислоты цистеин. Конечный продукт – сульфид свинца – черного цвета.

2Н₂О

ЦИСТЕИН + 4NaOH + (СН₃СОО)₂ Рb СЕРИН + РbS + 4NaOH + +2CH₃COOH ацетат свинца сульфид

свинца

Ход работы: взять пробирку.

ОТМЕРИТЬ	О П Ы Т
Раствор белка NaOH, 30 % Раствор (СН3СОО)2 Рb 5 %	5 капель 5 капель 1 каплю
Кипятить до появления окраски.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода. БЕЛОК + NaOH/CuSO₄ = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

Ход работы: взять две пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	О П Ы Т
Реактив Горнала сыворотка NaCl 0,9 %	4,0 мл - 0,1 мл	4,0 мл 0,1 мл -
Перемешать, фотометрия через 20 минут. Кювета 10 мм, l = 540 нм (зеленый светофильтр)

РЕЗУЛЬТАТ: измерение на колориметре проводят против контрольной пробы и отмечают экстинцию. E_оп =

Конечный результат: определяют по калибровочному графику.

C_оп = г/л

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых - 65-85 г/л, у новорожденных 47-65 г/л, у детей 2-14 лет 62-80 г/л.

Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;

Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.

ВЫВОД:

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 3

РАБОТА № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Обоснование выполнения работы: демонстрируют влияние химических факторов на устойчивость белков в растворах.

Принцип метода: белок осаждается вследствие химической денатурации белка и образования комплексной соли белка с кислотами.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ
HNO3 концентрированная   Раствор белка	10 капель -   10 капель

Наклонив пробирки под углом 45^о, осторожно по стенке пробирки приливают раствор белка так, чтобы обе жидкости не смешивались.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. РАЗДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ И ГЛОБУЛИНОВ ЯИЧНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ

Обоснование выполнения работы. Высаливанием обратимо осаждают белки, фракционируют их. Используют для выделения белков, в том числе ферментов.

Принцип метода. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. Осаждение белка обратимо и зависит от молекулярной массы белка и дегидратирующей способности растворов нейтральных солей.

Ход работы: взять две пробирки (опыт 1 и опыт 2).

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ 1	ОПЫТ 2
Раствор белка NaCl (порошок)   (NH4)2SO4 насыщенный раствор (100 %)	1,0 мл до насыщения (100%) -     Отставить на 10 минут	1,0 мл -   1,0 мл (получится 50% раствор)   Без инкубации
Р Е З У Л Ь Т А Т:
	Отфильтровать	Отфильтровать
(NH4)2 SO4 (порошок)	Прокипятить	Добавить соль до насыщения
Р Е З У Л Ь Т А Т:

В Ы В О Д:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 4

РАБОТА № 1. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Обоснование выполнения работы. Гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.

В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.

Принцип метода. Большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.

Ход работы:

1. В химическую колбу внести 20 мл раствора яичного белка.

¯

2. Добавить 5 мл концентрированной НCl.

¯

3. Отлить 0,5 – 1 мл смеси в пробирку (№ 1), (5 капель).

¯

4. Колбу закрыть резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой (обратный холодильник).

¯

5. Содержимое колбы кипятить под вытяжкой в течение 45 минут.

¯

6. После охлаждения отлить 0,5 – 1 мл гидролизата в пробирку (№ 2) (5 капель).

¯

7. Нейтрализовать содержимое пробирок 20 % NaOH по лакмусу до голубой окраски.

¯

8. Провести биуретовую реакцию в пробирках № 1 и № 2.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА

Обоснование выполнения работы. Протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.

Принцип метода. Протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.

Ход работы: взять две центрифужные пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	О П Ы Т
Раствор белка Фосфатный буфер рН 8,0 ТХУ, 10 % Раствор трипсина	0,5 мл   1,0 мл 2,0 мл 0,5 мл	0,5 мл   1,0 мл - 0,5 мл
Инкубация 20 минут, при 37оС в термостате
ТХУ, 10 %		2 мл
Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин. Центрифугат перелить в сухие пробирки.
раствор NaOH 0,5 М фенольный реактив	5,0 мл 0,5 мл	5,0 мл 0,5 мл
Размешать. Инкубация 20 минут при 18оС

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 5

РАБОТА № 1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).

Принцип метода:

амилаза амилаза

Крахмал ® декстрины ® мальтоза.

Крахмал дает с иодом синий цвет.

Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.

Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки, опыт 1-3. Развести слюну 1 : 10 (1мл слюны в отдельной пробирке + 9 мл Н₂О).

ОТМЕРИТЬ	ОПЫТ-1	ОПЫТ-2	ОПЫТ-3
Крахмал 1 % Амилаза слюны (разведение 1:10)	0,5 мл 0,5 мл	0,5 мл 0,5 мл	0,5 мл 0,5 мл
Поместить пробирки на 10 минут	Комнатная температура (20оС)	Термостат (40оС)	Кипящая водяная баня (100оС)
Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 капли KJ 1%

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

РАБОТА № 2. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.

Принцип метода. При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные.

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ 1	ОПЫТ 2
Н2О NaCl 1 % CuSO4 1 % Амилаза слюны (1: 10) Крахмал 1%	10 капель - - 20 капель 5 капель	8 капель 2 капли - 20 капель 5 капель	8 капель - 2 капли 20 капель 5 капель

¯

Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут

(10, 15 минут).

¯

Добавить по 2-3 капли раствора йода во все пробирки.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ

ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. В качестве рабочего раствора используется 0,01 н. раствор йода.

ХОД РАБОТЫ:

Длина волны 630-690 нм (красный светофильтр), кювета с толщиной слоя 1 см.

В 2-х пробирках (опытной и контрольной) проводят анализ согласно таблице:

КОМПОНЕНТЫ	ОПЫТНАЯ ПРОБА	КОНТРОЛЬНАЯ ПРОБА
Раствор стойкого крахмального субстрата	0,5 мл	0,5 мл
прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С
Негемолизированная сыворотка крови	0,01мл	-
прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С
Рабочий раствор йода (0,01 н.)	0,5 мл	0,5 мл
Дистиллированная вода	4 мл	4 мл
Негемолизированная сыворотка крови	-	0,01 мл
пробирки встряхивают, и растворы фотометрируют относительно воды

РАСЧЕТЫ. Расчет активности α-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37°С производят по формуле:

Е_к – Е_оп

Х = ×240

Е_к

Е_к – экстинкция контрольной пробы;

Е_оп – экстинкция опытной пробы.

РЕЗУЛЬТАТ:

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность α-амилазы в сыворотке крови в норме = 16-30 г/час×л, в моче – 28-160 г/час×л.

Повышение активности фермента наблюдается при паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.

Снижение активности α-амилазы отмечается при атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.

ВЫВОД:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 6