Зависимость эффективного разделения фрагментов ДНК разных размеров от концентрации агарозы в геле

Тема занятия 2: АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот и их фрагментов в полиакриламидных и агарозных гелях отличается от разделения белков рядом особенностей, обусловленных структурой этих биополимеров. В нейтральной и щелочной средах молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поскольку их заряд определяется диссоциацией фосфатных групп. Величина этого заряда мало зависит от рН окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот. Таким образом, фракционирование идет за счет размеров и формы молекул. Для электрофоретического разделения полинуклеотидов используют эффект молекулярного сита, присущий полиакриламидным и агарозным гелям. Для фракционирования фрагментов ДНК размером меньше 100 пар нуклеотидов обычно используют полиакриламидные гели с разными концентрациями полиакриламида (3,5% – 20%). Более крупные молекулы ДНК разделяют в агарозном геле.

Рис.1 Зависимость пробега фрагмента ДНК от его размера при электрофорезе в агарозном геле

Скорость миграции нуклеиновых кислот через агарозный гель зависит от ряда факторов. Скорость миграции в целом уменьшается при увеличении размеров фрагментов линейной ДНК (но лишь до определенного предела). Молекулы больше 30 т.п.н. не могут быть разделены обычным электрофорезом в агарозном геле, так как такие фрагменты ДНК мигрируют практически с одинаковой скоростью независимо от их молекулярной массы. В области же эффективного разделения пройденное расстояние в геле (пробег) линейных двуцепочечных молекул ДНК обратно пропорционально десятичному логарифму их молекулярных масс. Фрагменты ДНК определенного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разной скоростью. Чем выше концентрация агарозы, тем эффективнее разделение фрагментов меньшего размера, и наоборот.

Зависимость эффективного разделения фрагментов ДНК разных размеров от концентрации агарозы в геле

Концентрация агарозы в геле, %	Область эффективного разделения макромолекул ДНК, т.п.н.
0,5	1 000 – 30 000
0,7	800 – 12 000
1,0	500 – 10 000
1,2	400 – 7 000
1,4	200 – 4 000
2,0	50 – 2 000

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется также конформацией молекул. В суперспирализованной форме молекула ДНК наиболее компактна и обладает наибольшей подвижностью. Релаксированная форма (образующаяся при наличии хотя бы одного разрыва сахарофосфатной цепи в одной из цепей ДНК) имеет значительно меньшую электрофоретическую подвижность. При низких и средних концентрациях агарозы линейная ДНК той же молекулярной массы обладает промежуточной подвижностью между суперспирализованной и релаксированной формами. Скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению только при низких значениях напряженности электрического поля. При увеличении напряженности подвижность высокомолекулярных фрагментов дифференциально возрастает. При этом снижается область эффективного разделения ДНК в агарозном геле. Максимальное разделение фрагментов достигается при напряженности электрического поля, не превышающей 5 В/см.

Для электрофореза ДНК обычно применяют буферы, содержащие трис-ацетат, трис-борат и трис-фосфат. Все три буферные системы обеспечивают хорошее разделение фрагментов в равной степени. Буферы для электрофореза ДНК обычно содержат хелатирующий агент ЭДТА для связывания двувалентных катионов Ca²⁺и Mg²⁺, что предотвращает распад ДНК под действием эндо- и экзонуклеаз, активность которых зависит от присутствия в среде этих катионов.

Для наблюдения за ходом электрофореза в пробу добавляют лидирующие красители (бромфеноловый синий и ксиленцианол) до конечной концентрации примерно 0,04%. Для удобства нанесения образцов (для «утяжеления» проб) в них добавляют глицерин до конечной концентрации 5%.

Наиболее удобным методом визуализации ДНК в агарозных гелях является окрашивание ее флуоресцирующим красителем бромистым этидием, который специфически интеркалирует между азотистыми основаниями в ДНК. Ультрафиолетовое излучение, поглощаемое ДНК в области 260 нм, передаваемое на краситель, а также излучение, поглощаемое самим красителем при 300 нм, испускается затем в красно-оранжевой области видимого спектра.

Задание 1. Электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле

Ход работы:

1. 1%-й агарозный гель остудить до температуры 50ºС. Перед заливкой геля тщательно проверить горизонтальность поверхности заливочного столика с помощью уровня; установить гребенку на подложку. Необходимо, чтобы между концом гребенки и подложкой оставался просвет 0,5 – 1 мм для формирования дна кармана. Во время процедуры заливки необходимо следить, чтобы в геле не было пузырьков воздуха. Толщина геля должна составлять 0,3 - 0,5 см. После того, как гель полностью застынет, осторожно вынуть гребенку и поместить гель в электрофорезную камеру (рис.2).

Рис.2. Схема заливки геля

1. Добавить в камеру трис-ацетатный буфер (1х ТАЕ: 0,04 М трис-ацетат, рН 7,6, 0,002 М ЭДТА) так, чтобы гель был полностью покрыт буфером.
2. Разморозить пробы, приготовленные на прошлом занятии. Перемешать пробы и собрать капли на микроцентрифуге.

4. Нанести пробы в карманы геля под буфер с помощью автоматической пипетки. Кроме опытных проб на две крайние дорожки нанести маркер молекулярных масс.

Пробы для нанесения на гель:

	Маркер для определения размеров фрагментов ДНК «GeneRuler™ 1000 п.н.» (0,1 мкг/мкл)	Исходная плазмидная ДНК	Плазмидная ДНК, рестрицированная EcoRI (1-я реакционная смесь)	Плазмидная ДНК, рестрицированная PstI (2-я реакционная смесь)
Общий объем пробы для нанесения

5. Закрыть электрофоретическую камеру и включить напряжение. ДНК движется в электрическом поле от катода (-) к аноду (+). Напряженность электрического поля должна составить 2 В/см в течение первых 15 мин для вхождения проб в гель (30 – 40 В) и затем 3 – 5 В/см (60 – 70 В) в течение примерно 1 – 1,5 ч.

6. После того, как бромфеноловый синий пройдет примерно ¾ геля, выключить напряжение, гель поместить в кювету с раствором бромистого этидия (1 мкг/мл на 0,001 М ЭДТА).