Будова мікроскопа та методи мікроскопії

Вивчення морфології та будови клітин мікроорганізмів, розмір яких визначається здебільшого мікрометром (1 мкм = 0,001 мм), можливе лише за допомогою мікроскопів, які забезпечують збільшення досліджуваних об'єктів у сотні (світлові мікроскопи), десятки і навіть сотні тисяч разів (електронні мікроскопи).

Мікроскоп (від гр. місrоs – малий, sсорео – дивлюсь) – оптичний прилад, що дає можливість отримати збільшене зображення дрібних предметів та їх деталей. У даному разі мікроскоп слугує для вивчення живих і вбитих мікроорганізмів (забарвлених і незабарвлених). Найпоширеніші моделі біологічних мікроскопів, які допомагають досліджувати об’єкти у прохідному світлі: МБІ, МБР, „Мікромед”, „Биолам" та ін.

Біологічний мікроскоп (рис.1) складається з двох частин – механічної та оптичної. Механічна частина мікроскопа має штатив, предметний столик, тубус з револьверною головкою, макро- і мікрометричний гвинти.

Нижня частина штатива є опорою мікроскопа 12 , верхня ( у формі дуги) – тубусотримачем 8 .

Рис. 1. Біологічний мікроскоп Биолам 70:

1 – дзеркало;2 – конденсор; 3 –предметний столик;4 – об'єктив; 5 – револьвер; 6 – окуляр; 7 – тубус; 8 – тубусотримач; 9 – гвинти для переміщення предметного столика; 10,11 – відповідно макрометричний і мікрометричний гвинти; 12 – основа штатива.

У верхній частині тубусотримача міститься револьвер 5, що обертається навколо своєї осі. У три-чотири отвори нижньої пластики револьвера вгвинчуються об’єктиви 4. Обертанням пластини револьвера будь-який об'єктив можна підвести під тубус, центрування об'єктива по осі мікроскопа точно фіксується пружиною.

Револьвер має гніздо для кріплення похилого чи вертикального тубуса 7. Похилий тубус можна повернути навколо вертикальної осі в будь-яке зручне положення і закріпити гвинтом. У нижній його частині розміщується призма, яка заломлює оптичну вісь мікроскопа під кутом 45° до горизонтальної площини. У верхній кінець тубуса вкладаються змінні окуляри 6.

Тубусотримач разом з тубусом можна переміщувати по вертикалі на 50 мм за допомогою механізму, змонтованого в основі штатива 12. Механізм приводять у дію обертанням макрометричного 10 і мікрометричного 11 гвинтів. Макрометричний гвинт використовують для швидкого переміщення тубуса в обидва боки (вгору і вниз) по оптичній осі мікроскопа і для початкового грубого наведення на фокус. Один його оберт відповідає лінійному переміщенню тубуса на 1 мм.

Мікрометричний гвинт призначений для тонкого фокусування. Повний оберт мікрометричного гвинта переміщує тубус на 0,1 мм. Барабан гвинта розділений на 50 поділок, кожна з них відповідає переміщенню тубуса на 0,002 мм (тобто 2 мкм). Мікрометричний гвинт дуже крихкий, тому з ним слід поводитися дуже обережно. При обертанні гвинта за годинниковою стрілкою тубусотримач мікроскопа (разом з окуляром і об'єктивами) опускається, проти годинникової стрілки – підіймається.

Предметний столик 3 мікроскопа має круглу чи прямокутну форму, в його центрі є отвір для проходження променів, які освітлюють препарат. Столик можна переміщувати в горизонтальній площині за допомогою двох гвинтів 9, розміщенних праворуч і ліворуч. Столик має два затискачі для закріплення препарату. Під предметним столиком на штативі закріплено кронштейн конденсора, що переміщується у межах 20 мм за допомогою спеціального гвинта.

Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального апарата, об’єктивів і окулярів.

Освітлювальний апарат міститься під предметним столиком. Він складається з дзеркала 1 і конденсора 2 з діафрагмою.

Дзеркало зафіксоване на основі штатива, має два боки (увігнутий і плоский) і використовується для спрямування променів світла на препарат. Увігнуте дзеркало збирає і концентрує в площині препарату пучок паралельних променів, що йдуть від джерела світла; при денному світлі зазвичай використовують плоский бік дзеркала.

Конденсор, закріплений над дзеркалом, складається з двох лінз: верхньої – плоско-опуклої, нижньої – двоопуклої. Плоский бік верхньої лінзи може бути піднятий так, що відстань між конденсором і предметним столиком мікроскопа дорівнюватиме 0,1 мм. Конденсор призначений для збирання паралельних променів, що йдуть від джерела світла і відбиваються дзеркалом, в одній точці – фокусі, яка має бути в площині препарату. Забарвлені мікроорганізми досліджують з піднятим угору конденсором, досягаючи у такий спосіб повного освітлення препарату. Незабарвлені мікроорганізми розглядають з опущеним конденсором: поле зору затемнюється, кут заломлення світлового променю у середовищі та мікроскопічному об’єкті не є одинаковим і клітини стають видимими.

Під конденсором містяться ірис-діафрагма і відкидна оправа для світлофільтра. Ірис-діафрагма потрібна для затримання зайвих променів світла і складається із сталевих пелюстків, її отвір можна розширити або звузити за допомогою важеля. Будова ірис-діафрагми нагадує зіницю ока. Якщо використовують забарвлені препарати або розсіяне світло, діафрагму розширюють, а у разі розглядання незабарвлених препаратів та при яскравому освітленні її звужують і поліпшують контрастність.

Об'єктив 4 складається з системи шліфованих лінз, склеєних канадським бальзамом і вміщених у металеву оправу. Одне з позначень, які є на оправі, відповідає ступеню власного збільшення об’єктива – 8х, 40х і 90х разів. Робочою лінзою об’єктива є передня – фронтальна. Збільшення об'єктива залежить від її фокусної відстані, і отже, від кривизни. Що більша кривизна лінзи, то коротша фокусна відстань і більше збільшення об'єктива. Цю обставину потрібно враховувати у практичній роботі: що більше збільшення дає об’єктив, то нижче слід опускати його над площиною препарату; що менше збільшення об'єктива, то вище його положення (при збільшенні 8х відстань від фронтальної лінзи до покривного скла дорівнює 18,2 мм).

Інші лінзи об'єктива (їх може бути 10 і більше) розміщені вище, як фронтальна. Вони мають різну кривизну поверхні і виготовлені зі стекол з різними оптичними властивостями. Ці лінзи називаються корекційними і призначені не для збільшення, а для отримання чіткішого зображення.

Зображення, отримане за допомогою лінз, має ряд недоліків – аберацій, найістотнішими з яких бувають сферична та хроматична. За сферичної аберації кожна точка об'єктива має вигляд кружальця, тобто отримане зображення не чітке, а розмите; за хроматичної аберації зображення набуває нового забарвлення, якого в об'єктиві немає.

Об'єктиви, в яких сферична і хроматична аберації скориговані не повністю, називаються ахроматами. Вони містять до шести лінз і дають найчіткіше зображення в центрі. Краї поля зору часто бувають забарвлені в різні кольори спектра. Ахромати поширені завдяки своїй простоті і дешевизні.

Сучасні об'єктиви – апохромати складаються з 10 – 12 лінз. У них майже в 10 разів менша, ніж у ахроматів, хроматична похибка, а також отримується більш рівномірна чіткість зображення.

Крім власного збільшення, на металевій оправі об'єктивів зазначені її числові апертури (0,20; 0,65; 1,25). Числова апертура А визначається добутком синуса половини кута U , під яким світло може потрапити в об'єктив, на показник заломлення середовища n , яке межує з лінзою:

А=sin U × n (рис.2). Числову апертуру можна підвищити, якщо між фронтальною лінзою та об'єктом вмістити краплю рідини, показник заломлення якої буде більший ніж показник заломлення повітря (n=1). Наприклад, якщо краплю води (n =1,3), гліцерину (n=1,4) або кедрової олії (n=1,515) наблизити до показника заломлення скла (n=1,52), промені, проходячи через середовища приблизно однакової густини, не заломлюються, збільшується sin U, який становить <1, чим досягається краще освітлення розглянутого об'єкта. Такі об'єктиви називають імерсійними. Вони відрізняються від сухих зовні: на їх оправі є чорна кругова нарізка. Крім того, на ній вигравійоване позначення: МІ– масляна імерсія.

Рис. 2Схема проходження

променів при різній величині

кута u: A – об’єкт; O - об’єктив;

α– кут отвору;

u - половина кута отвору.

У біологічному мікроскопі застосовуються два типи об'єктивів: сухі та імерсійні. Під час роботи з сухими об'єктивами (8× і 40×) між фронтальною лінзою і препаратом міститься повітряний прошарок: імерсійний об’єктив (90×) занурюють у краплю олії, яку наносять на покривне скло. Робота з таким об'єктивом вимагає обережності через дуже коротку фокусну відстань його фронтальної лінзи.

Окуляр 6 (див. рис. 3.1) має дві лінзи: очну (верхню) і збиральну (нижню). Окуляри мають власне збільшення в 5×, 7×, 10×, 12×, 15× і 20× разів, яке позначено на їхній оправі. Спеціальні, так звані компенсаційні, окуляри використовуються з апохроматами. Вони сконструйовані таким чином, що дають хроматичну похибку, обернену до залишкового хроматизму апохромата і тому таку, що її компенсує. На оправі компенсаційних окулярів є позначка "Комп.". В окулярі між лінзами є неповна перегородка – діафрагма, яка відсікає крайові промені і робить зображення чіткішим.

У результаті поєднання лінз в об’єктиві та окулярі хід променів у мікроскопі дає остаточне зображення об’єкта, яке буває збільшеним, оберненим і уявним (рис. 3).

Рис.3. Схема утворення зображення у світловому мікроскопі: А – об’єкт; О – об’єктив; Е –окуляр; А' – зображення об’єкта А; Х– лінія зображення; Z– дійсне зображення

Загальне збільшення мікроскопа визначається добутком збільшення об’єктива на збільшення окуляра. Отже, застосовуючи різні комбінації окулярів і об’єктивів, можна збільшити досліджувані об’єкти в світловому мікроскопі у 80 (8х10) – 1350 (90х15) разів.

Чіткість отриманого зображення визначається роздільною здатністю мікроскопа, під якою розуміють мінімальну відстань між двома точками (двома штрихами), коли вони не зливаються в одну точку (лінію). Що більше роздільна здатність мікроскопа, то меншого розміру об’єкт можна побачити.

Роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі використаного світла і суми числових апертур об’єктива і конденсора:

де l – довжина хвилі використаного світла; А₁, А₂ – числові апертури відповідно об’єктива і конденсора.

Роздільна здатність неозброєного ока становить 200 мкм, тобто 0,2 мм. Покращити роздільну здатність мікроскопа можна у два способи: освітлюючи об’єкт ще більш короткохвильовими променями світла, наприклад ультрафіолетовими, або збільшуючи апертуру об’єктива і конденсора. Апертура об’єктива збільшується при його імерсії краще в кедровій олії. Апертуру конденсора можна також збільшити до 1,2, вміщуючи імерсійну олію між верхньою лінзою конденсора і нижньою поверхнею предметного скла.

Освітлювач – невід’ємна частина мікроскопа. У багатьох сучасних мікроскопах освітлювальний апарат разом з джерелом світла вмонтований в основу мікроскопа. У мікроскопів інших систем такого пристрою немає, тому в такому разі застосовують спеціальні освітлювачі.

Методи мікроскопії

Метод фазово-контрастної мікроскопії дає можливість перетворити невидимі фазові зміни, що відбуваються зі світловою хвилею під час її проходження через мікробну клітину, на видимі амплітудні й тим самим підвищити контрастність зображення. Оптична система, використовувана для одержання фазового контрасту, складається з фазової пластини 1 і кільцевої діафрагми 5 (рис.3.4).

Фазова пластина – це коло напилювання із солей рідких металів на одну з лінз об'єктива. Вона забезпечує зміну фази проходжуваної хвилі світла на 1/4, що приводить до перетворення фазових розходжень на амплітудні. Кільцева діафрагма – це непроникна для світла пластина з прозорою щілиною у вигляді кільця, через яку надходить світло в конденсор 4. Фазовий ефект виникає лише при точному сполученні фазового кільця з проекцією кільцевої діафрагми 3. До складу фазово-контрастного пристрою входять: набір фазових об’єктивів 2, що мають на металевій оправі, крім вказівника збільшення, позначку «Ф»; револьверний конденсор 4 з набором кільцевих діафрагм, кожна з яких відповідає фазовій пластинці певного об’єктива; допоміжний мікроскоп, призначенням якого є центрування кільцевої діафрагми стосовно фазової пластинки об’єктива.

Мікроскопія в темному полі ґрунтується на висвітленні об’єкта навскісними променями світла. Ці промені не потрапляють в об’єктив, тому поле зору виглядає темним. Якщо препарат містить клітини мікроорганізмів, то навскісні промені, проходячи через такий препарат, значною мірою відбиваються від поверхні клітин і настільки відхиляються від свого первісного напрямку, що потрапляють в об’єктив 1. Тоді спостерігачеві на чорному тлі видно інтенсивно світлі об’єкти, навіть якщо їхній діаметр у 10 разів менший, ніж роздільна здатність об’єктива. Таке висвітлення препарату досягається застосуванням спеціального конденсора 2. Темнопольовий конденсор має затемнену середню частину 3, тому центральні промені світла, що йдуть від дзеркала, затримуються, а в площину препарату потрапляють тільки бічні промені, відбиті від дзеркальних поверхонь, розташованих усередині конденсора (рис. 5).

При мікроскопуванні в темному полі можна побачити об’єкти, розміри яких вимірюються сотими частками мікрометра, тобто перебувають за межами видимості звичайного мікроскопа. Однак спостереження об’єктів у темному полі дає змогу розрізнити тільки їхні контури, але не розглянути внутрішню будову.

Люмінесцентна мікроскопія ґрунтується на здатності ряду речовин біологічного походження (хлорофіл, вітамін В, деякі алкалоїди й антибіотики тощо) і деяких барвників світитися під впливом світла, що попадає на них. Молекули речовин, здатних до люмінесценції, поглинають енергію, переходячи на вищий енергетичний рівень. Проте у такому стані вони перебувають нетривалий час і знову повертаються до вихідного енергетичного рівня. Цей перехід супроводжується віддачею надлишку енергії у вигляді світла – люмінесценцією, причому освітлюваний об’єкт випускає промені енергетично менш багаті, тобто з більшою довжиною хвилі, ніж промені збуджуючого світла. Тому викликати люмінесценцію можна або короткохвильовою частиною видимого спектра (синьо-фіолетові промені, l = 460 нм), або ультрафіолетовими променями (l = 360-380 нм). В обох випадках виникає люмінесценція в кольоровій гамі видимого спектра, тобто отримують кольорове зображення об’єкта. Більшість мікробних клітин мають дуже слабку власну чи первинну люмінесценцію, тому їх обробляють водяними розчинами спеціальних барвників – флуорохромів, до числа яких належать акридин жовтогарячий, берберин тощо.

Електронна мікроскопія. Для вивчення об’єктів і структур, розміщених за межами видимості звичайних мікроскопів, застосовують електронні мікроскопи. Їх роздільна здатність дорівнює 1 – 40 А°, збільшення – в середньому 105 разів. Будова електронного мікроскопа (рис. 6) в принципі аналогічна будові світлооптичного мікроскопа. Окремі його вузли подібні до вузлів звичайного світлового мікроскопа, перевернутого окуляром униз, але роль світлових променів в ньому відіграє пучок електронів, випромінюваних спеціальним джерелом – електронною гарматою 1; як лінзи виступає кругове магнітне поле, під дією якого електрони можуть відхилятися або центруватися. Функція конденсорної лінзи 2 електронного мікроскопа аналогічна функції, виконуваній конденсором звичайного мікроскопа – зведення пучка електронів в одній точці на об’єкті. Пройшовши через об’єкт 3, електрони попадають в об’єктну лінзу 4, що знову фокусує розбіжний пучок і дає перше проміжне зображення об’єкта 5. Магнітний проектор 6 (проекційна лінза, аналогічна за призначенням лінзи окуляра) дає остаточне збільшення зображення об’єкта 7 на флуоресцентному екрані – металевій пластинці, покритій тонким шаром сірчистого цинку чи мінералу вілліміту.

У разі фокусування (потрапляння) в екран електронних променів кожна частинка цього шару починає світитися.

Препарати для електронно-мікроскопічних досліджень наносять на спеціальні сітки, покриті якнайтоншою целюлозною чи пластмасовою плівкою (підкладкою); загальна товщина препарату і підкладки має не перевищувати 250 мкм.