Методы определения вирулентности бактерий и активности бактериальных токсинов на экспериментальных животных

Экспериментальное заражение животных. Инфек­ционный процесс может быть искусственно воспроизведен пу­тем заражения лабораторных животных: кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Это производится для изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов, вы­деления чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы), воспроизведения экспериментальной ин­фекции и других целей.

Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, перорально, интраназально, интратрахеально и интрацеребрально. Все ма­нипуляции осуществляют с помощью стерильных инструмен­тов. Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют. Мышь берут за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой и фиксируют животное в левой руке в растянутом положении. Взвесь микроорганиз­мов определенной концентрации набирают в шприц через иг­лу. Шприц держат как писчее перо в правой руке. При под­кожном заражении иглой прокалывают кожную складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содержимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом. При внутрибрю-шинном заражении животное фиксируют головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым уг-

Рис.9.1.1. Дермонекротическая проба, а — отрицательная реакция; б — положительная реакция.

лом, затем переводят шприц в положение, перпендикулярное к брюшной стенке, толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца.

Дермонекротическая проба. Кролику внутрикожно вводят 0,2 мл бульонной испытуемой культуры туберкулино­вым шприцом с тонкой иглой. В положительном случае через 2—3 сут на месте введения образуется очаг некроза (рис. 9.1.1).

Кератоконъюнктивальная проба (Шереня). Суточ­ную агаровую культуру бактерий стандартной петлей диамет­ром 5 мм вводят под нижнее веко глаза морской свинки. Через 2—4 сут оценивают выраженность кератоконъюнктивита по наличию помутнения роговицы, нагноения и изъязвления.

Определение летальной дозы микробных токси­нов. Оценивают количество токсина, вызывающеее гибель 50 % животных, которым вводилось данное вещество. С этой целью готовят ряд десятикратных разведений и вводят отдельным груп­пам животных. Через определенный срок отмечают число погиб­ших в каждой группе животных и производят расчет LD$q.

Бактериологическое исследование трупов живот­ных. Для обнаружения микроорганизмов, вызвавших гибель животного, определения их локализации в организме и выде­ления чистой культуры возбудителя производят вскрытие за­раженного животного сразу после его гибели, соблюдая пра­вила асептики во избежание загрязнения посторонними бак­териями. Мышь помещают брюшком кверху на марле, смо­ченной дезинфицирующим раствором, поверх слоя застывшего парафина в ванночке и прикрепляют булавками за лапки. Тщательно обрабатывают кожу раствором какого-либо анти­септика. Вскрытие производят стерильными инструментами (рис. 9.1.2).

Делают продольный разрез кожи по прямой линии от ниж-

Рис.9.1.2. Вскрытие мыши, а—г — этапы вскрытия.

ней челюсти до лобка, осторожно отсепаровывают лоскуты кожи в стороны. Отмечают состояние подкожной жировой клетчатки и лимфатических узлов, при необходимости делают из них мазки-отпечатки и посевы.

Грудную полость вскрывают поперечным разрезом под ме­чевидным отростком и двумя продольными разрезами через Ребра параллельно грудине. Откладывают вырезанный лоскут и осматривают органы грудной полости, отмечая в протоколе наличия экссудата. Для посева крови из сердца его поверхность прижигают раскаленным кончиком пинцета и вводят капилляр стерильной пипетки в полость сердца. Затем каплю крови из

пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпечатки и делают посевы.

Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брю­шины ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы брюшной полости, отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию печени, селезенки, надпочеч­ников, брыжеечных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды.

Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе и окраши­вают метиленовым синим. При микроскопии отмечают при­сутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов учитывают на следующий день после ин­кубации в термостате. Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.

Глава 10

ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Достижения современной фундаментальной иммунологии находят применение в области прикладной иммунологии, ко­торая занимается вопросами иммунодиагностики, иммунотера­пии, иммунопрофилактики и иммунокоррекции. Иммунодиаг­ностика решает несколько разных диагностических задач: оценки иммунного статуса организма, выявления и идентифи­кации специфических антигенов, выявления и количественно­го определения содержания специфических антител в сыворот­ке крови и других биологических жидкостях (серодиагностика), оценки эффективности клеточного и гуморального специфи­ческого иммунного ответа на конкретный антиген. Иммуноте­рапия включает применение иммунных сывороток или имму­ноглобулинов, содержащих специфические антитела, с целью лечения или экстренной профилактики конкретного заболева­ния путем создания пассивного иммунитета, а именно — вве­дения в организм готовых антител, способных нейтрализовать токсин или вирус и обеспечить специфическую защиту против возбудителя. Значительно реже с целью лечения хронических инфекций применяют препараты вакцин. Вакцины и анаток­сины составляют арсенал иммунопрофилактики, которая пре­следует цель индуцировать в организме человека выработку собственного активного иммунитета против конкретного анти­гена, входящего в состав вакцины или анатоксина. При выяв­лении у больного какого-либо типа иммунопатологии с целью иммунокоррекции используют препараты: иммунодепрессанты или иммуностимуляторы.

Тема 10.1.МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ

Специфичность и прочность связывания антигена с анти­телами позволяют использовать антитела для выявления и идентификации молекул антигенов в составе микроорганиз­мов, их продуктов, в клетках, тканях и биологических жидкос­тях организма. Для этого можно применять методы непосред­ственного связывания меченых антител известной специфич­ности с местами локализации соответствующего антигена. Ис­пользуют различные варианты метки антител: флюоресцент­ную, ферментную или радионуклидную. Обязательным усло­вием является сохранение нативной структуры антигена, кото­рое обеспечивает возможность связывания антител с неизме­ненными эпитопами на его поверхности (рис. 10.1.1).

Другая группа методов выявления и идентификации анти­генов включает реакции, которые проявляются изменением свойств антигена после взаимодействия со специфическими антителами: склеиванием клеток, выпадением в осадок из кол­лоидного раствора, утратой токсичности, потерей подвижности и т.д. В соответствии с этими эффектами различают антитела: агглютинины (вызывающие агрегацию клеток, несущих ан­тигены), лизины (вызывающие разрушение клеточных мем­бран), преципитины (образующие преципитаты, осадки с рас­творимыми антигенами), антитоксины (нейтрализующие ток­сины).

Антигенные детерминанты (эпитопы)

Антиген

Рис. 10.1.1. Специфичность связывания антигена с антителом: эпитопа антигена с паратопом антитела.

Паратоп антитела

ПО

а План

Программа

1. Методы выявления и идентификации специфических антигенов, основанные на реакциях непосредственно­го связывания антигена с антителами: иммунофлюо-ресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуно-ферментный метод.

2. Методы выявления и идентификации специфических антигенов, основанные на реакциях связывания анти­гена с антителами, проявляющихся изменением свойств антигена: реакция агглютинации, реакция преципита­ции, реакция иммобилизации, реакция нейтрализа­ции.

Демонстрация

1. Иммунофлюоресцентный метод для индикации при­сутствия в исследуемом материале возбудителей: бак­терий или вирусов.

2. Наборы ингредиентов для иммуноферментного и ра­диоиммунного методов.

3. Иммуноэлектрофореграммы.

Задание студентам

1.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации выделенной чистой культуры бактерий. Сделать заключение по результа­там реакции.

2. Протоколировать и оценить результаты РИГА, постав­ленной с целью выявления и идентификации бакте­риального экзотоксина в исследуемом материале. Сде­лать заключение по результатам реакции.

3. Протоколировать и оценить результаты реакции пре­ципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенности возбудителя дифтерии. Сделать заклю­чение по результатам реакции.

4. Протоколировать и оценить результаты РТГА, постав­
ленной с целью идентификации по гемагглютининам
выделенного вируса гриппа. Сделать заключение по
результатам реакции.

Методические указания

1. Иммунофлюоресцентный анализ.Один из наиболее чувст­вительных методов выявления связывания антител с антигена­ми в клетках и тканях — иммунофлюоресцентный анализ. Спе­циальный флюоресцентный краситель (флюорохром) прикреп­ляется химической связью к молекуле специфического анти­тела, не нарушая его специфичности. Часто используют кра­ситель изотиоцианат флюоресцеина, обладающий желто-зеле­ной флюоресценцией. Красители, выбранные для иммунофлю-

оресцентно^о метода, активируются светом одной длины вол­ны (чаще —1 ультрафиолетовой части спектра), а сами испуска­ют лучи другой длины волны (видимого спектра). В люмине­сцентном микроскопе используется в качестве источника све­та, возбуждающего люминесценцию, ртутная лампа с системой селективных! фильтров, пропускающих в окуляр только свет флюоресцирующего красителя. Прикрепляя разные красители к разным антителам, можно одновременно выявлять несколько антигенов в одной клетке.

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного мик­роорганизма в исследуемом материале, в связи с чем его на­зывают методом экспресс-диагностики.

Недостатком прямого иммунофлюоресцентного метода яв­ляется необходимость приготовления широкого набора флюо­ресцирующих специфических антител против каждого из изу­чаемых антигенов. Поэтому чаще используют непрямой имму­нофлюоресцентный метод, при котором связанные с антиге­ном специфические антитела (немеченые) выявляются с помо­щью флюоресцирующих антииммуноглобулиновых антител против иммуноглобулинов того вида, которому принадлежат антиген-специфические антитела.

Применяют и иммуногистохимический метод, при котором к специфическим антителам прикрепляется фермент (напри­мер, пероксидаза хрена), способный превратить бесцветный субстрат в окрашенные продукты его ферментативного разло­жения, видимые в обычный световой микроскоп.

Для использования при электронной микроскопии антиген-специфические антитела можно метить частицами золота, ло­кализация которых укажет на расположение соответствующего антигена.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса спе­цифические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люмине­сцентной микроскопии препаратов (рис. 10.1.2).

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобули-новой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов, поскольку диагностические антисыворотки получают путем иммунизации кроликов. При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируют­ся флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, обеспечи­вая его свечение при люминесцентной микроскопии (см. рис. Ю.1.2).

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого мате­риала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кро­личьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген—антитело

Рис. 10.1.2. Иммунофлюоресцентный метод Кунса.

i — прямой метод; б — непрямой метод: АГ — антиген, AT - антитело,

АГС — антиглобулиновая сыворотка.

препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связывающихся с антигеном антител. Затем на препарат нано­сят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоничес­ким раствором хлорида натрия. В результате связывания флю­оресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированны­ми на антигене специфическими антителами образуются све­тящиеся комплексы антиген—антитело, которые обнаружива­ются при люминесцентной микроскопии.

2. Иммуноферментный анализ.Один из наиболее распростра­ненных в практике методов — иммуноферментный анализ (ИФА) — основан на использовании двух разных по специфич­ности моноклональных антител против двух разных антиген­ных эпитопов в составе искомого антигена. В лунки с иммо­билизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген—антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избыт­ка конъюгата антител с ферментом определяют количество свя­завшихся антител по их ферментативной активности в присутст­вии субстрата с индикатором. При этом величина активности фермента пропорциональна концентрации исследуемого антиге­на. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказы­вается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко рас­пространенного в литературе названия "сэндвич"-метод.

Повышение специфичности и чувствительности иммуно-ферментно^о анализа, так же как и иммунофлюоресцентного и радиоиммунного методов, связано с использованием моно­клональных! антител (МКАТ).

Для получения МКАТ мышей иммунизируют очищенным препаратом антигена, затем выделяют лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и проводят слияние их с миеломными клетками-партнерами. Неслившиеся миеломные клетки поги­бают, так как они дефектны по синтезу некоторых нуклеотидов и не могут выжить на селективной среде без этих нуклеотидов. Неслившиеся лимфоциты погибают в культуре из-за отсутст­вия в среде необходимых им трофических факторов. Выживают только гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от ми-еломных клеток способность к пролиферации в культуре, а от лимфоцитов — способность к синтезу антител соответствую­щей специфичности. Надосадочную жидкость культур гибри­дом исследуют с помощью ИФА с соответствующим антиге­ном. После выявления клеток, секретирующих нужные анти­тела, их клонируют методом лимитирующих разведений, т.е. клетки разводят таким образом, чтобы получить дочернюю культуру из одной клетки. Тогда все потомство будет генети­чески идентично: одна клетка дает один клон, который проду­цирует МКАТ.

3. Радиоиммунный анализ.Радиоиммунный анализ (РИА) является чрезвычайно чувствительным методом, который мо­жет быть использован для количественного определения лю­бого антигена. Чувствительность метода позволяет выявлять незначительные количества антигена.

Для проведения жидкостного радиоиммунного анализа очи­щенный известный антиген метят радионуклидами, чаще всего ¹²⁵1. В этом случае используют конкурентный вариант связы­вания, когда для определения количества антигена в исследу­емом образце оценивают его способность конкурировать с меченым референс-антигеном в связывании со специфическими антителами. Образующиеся комплексы антиген—антитело выде­ляют осаждением (сульфатом аммония или антиантителами) и определяют их радиоактивность в сопоставлении с радиоактив­ностью несвязанного антигена в надосадочной жидкости. Ис­пользование ряда концентраций немеченого антигена позволяет построить стандартную калибровочную кривую, с помощью которой определяется концентрация исследуемого антигена.

Более современный метод — твердофазный РИА, при кото­ром специфические антитела фиксируются на твердой фазе, к ним добавляется исследуемый антиген, а затем меченый стан­дартный антиген. Определение связанной и несвязанной метки позволяет построить калибровочную кривую и определить ко­личество исследуемого антигена.

РИА широко применяют для количественного определения

различных веществ: гормонов (инсулина, гормона роста, адре-нокортикотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, эст­рогена), белков сыворотки крови (IgE, сс-фетопротеина и др.), метаболитов (фолиевой кислоты, циклических нуклеотидов и др.), лекарственных препаратов (дигоксина, дигитоксина, мор­фина), микробных антигенов (HBsAg).

4. Реакция агглютинации. Влабораторной диагностике ин­
фекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто
применяют для идентификации видов и сероваров (серотипи-
рование) бактерий с помощью диагностических агглютиниру­
ющих сывороток. Реакция агглютинации (РА) на стекле (плас­
тинчатая реакция агглютинации) ставится с одним разведением
диагностической агглютинирующей сыворотки, которое в за­
висимости от ее титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100.

Предметное стекло делят на квадраты восковым каранда­шом. В один квадрат наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия, в другой — каплю сыворотки. Затем петлей в каждую каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры и перемешивают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлени­ем зерен и хлопьев агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 10.1.3).

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызван­ной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают R-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резуль­тате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеива­ние — наступает "кислотная" агглютинация. Чтобы ис­ключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с изотоническим раствором хлорида натрия.

5. Реакция непрямой гемагглютинации.Реакция непрямой
гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высо­
кой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агг­
лютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по
его антигенной структуре или для индикации и идентификации
бактериальных продуктов — токсинов — в исследуемом пато­
логическом материале. Соответственно используют стандарт­
ные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагности-
кумы, полученные путем адсорбции специфических антител на
поверхности танизированных (обработанных танином) эритро­
цитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последователь­
ные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку

Рис. 10.1.3. Реакция агглютинации на стекле, а — наличие агглютинации; б — отсутствие агглютинации.

вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антите­лами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят парал­лельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагружен­ными антителами разной групповой специфичности. Через 2 ч инкубации при температуре 37 "С учитывают результаты, оце­нивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компакт­ного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тон­кая пленка с неровными краями.

6. Реакция преципитации и ее варианты.Реакция преципи­тации характеризуется осаждением специфических мелкодис­персных антигенов эквивалентным количеством антител в при­сутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген—антитело в виде осадка наблюдается лишь при экви­валентных соотношениях ингредиентов, поскольку образовав­шийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного колло­идного раствора.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявле­ния или идентификации антигена (преципитиногена) по из­вестной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных растворов антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала (шкуры, шерсть, мясо животных).

Реакция преципитации проводится с прозрачными колло­идными растворимыми антигенами, экстрагированными из па­тологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагнос­тические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого пре­ципитата — помутнение (табл. 10.1.1).

Таблица 10.1.1. Постановка реакции преципитации (форма прото­
кола)____

Ингредиенты, мл	Опыт­ная проба	Номер контрольной пробирки

Стандартная преципитирующая 0,3 — 0,3 0,3 0,3 сыворотка

Нормальная кроличья сыворотка — 0,3 — — —

Экстракт исследуемого материала 0,3 0,3 — — —

Стандартный антиген _____

Контрольный экстракт — — 0,3 — —

Изотонический раствор хлорида — — — — 0,3
натрия
Результаты

Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципити-рующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторож­но переводят в вертикальное положение. Учет реакции произ­водят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появля­ется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробир­ках преципитат не образуется (рис. 10.1.4).

Реакция преципитации в геле. Чашки заливают ага­ром, в котором вырезают несколько лунок на равном рассто­янии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаровом геле в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы — дуги преципитации (рис. 10.1.5).

В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитирую-щей сыворотки — максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновид­ностей реакции преципитации в геле позволяет определить токсигенность исследуемых бактерий, например бактерий диф­терии (см. тему 14.2). При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются ли­нии преципитации в виде дуг (рис. 10.1.6).

7. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Иммуноэлектрофоретичес-кий анализ представляет собой сочетание электрофореза в ага­ровом геле с иммунодиффузией. Вначале проводят электрофо-ретическое разделение белков в агаровом геле. После разделе­ния в канавку, которая идет параллельно линии миграции

Рис. 10.1.4. Реакция преципитации.

1 — преципитирующая сыворотка + исследуемый материал; 2 — преципити­рующая сыворотка + гомологичный преципитиноген; 3 — преципитирующая сыворотка + контрольный экстракт без антигена; 4 — преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия; 5 — нормальная сыво­ротка + исследуемый антиген; 6 — нормальная сыворотка + контрольный экс­тракт без антигена.

Рис. 10.1.5. Реакция преципитации Рис.10.1.6. Определение токси-
в геле по Оухтерлони. генности коринебактерий диф-

терии в реакции преципитации в агаре.

белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Ан­тигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают пред­ставление о составе исходной смеси антигенов. ИЭФ — один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитирующими антисыворотками, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, молока,

экстрактов из органов, а также белки растительного и бакте­риального происхождения.

8. Реакция торможения гемагглютинации. Типирование виру­са проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса гриппа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологич­ных типоспецифических сывороток (табл. 10.1.2, 10.1.3).

Таблица 10.1.2. Постановка РТГА для типирования вируса

Манипуляции	Номера пробирок
	опытные	контрольные
						1к	2к	Зк

Приготовление разведе- 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:10

ний типоспецифической

сыворотки

Внесение сыворотки, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 — —

Внесение суспензии ви- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 —- 0,2 —

руса (4 гемагглютини-

рующие дозы в 0,2 мл)

Внесение изотоническо- — — — — — — 0,2 0,4

го раствора хлорида на­трия, мл

Экспозиция 60 мин при комнатной температуре Внесение 1 % суспензии 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 эритроцитов курицы, мл

Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре Учет результатов

Таблица 10.1.3. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Типоспецифи-	Разведение сыворотки	Контроль
вогриппозная сыворотка	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	сыво­ротки	виру­са	эрит­роци­тов

Условные обозначения: (+++) — наличие просветов в пленке; (++) — наличие пленки с фестончатыми краями из склеивающихся эрит­роцитов; (+) — хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; (—) — резко очерченный оса­док эритроцитов, неотличимый от контроля.

Тема 10.2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ (СЕРОДИАГНОСТИКА)

Количество специфических антител в сыворотке крови можно определить методами непосредственного выявления связывания со специфическим антигеном. Два наиболее совре­менных метода серологических исследований: радиоиммунный и иммуноферментный. В любом случае нужен известный очи­щенный антиген, к которому прикрепляется метка: радионук-лидная или ферментная. Соответственно связывание меченого антигена с антителами учитывается радиометрическим или спек-трофотометрическим методом.

Кроме методов непосредственного выявления связывания антител с антигеном, используют серологические исследова­ния, основанные на изменении свойств антигена: реакции агглютинации, преципитации, иммунного лизиса, связывания комплемента, нейтрализации.

▲ План

▲ Программа

1. Методы непосредственного выявления связывания ан­тигена с антителами: радиоиммунный метод, иммуно­ферментный метод, иммунофлюоресцентный метод.

2. Методы связывания антигена с антителами, проявля­ющегося изменением свойств антигена: реакция агг­лютинации, реакция преципитации, реакции иммун­ного лизиса, реакция связывания комплемента, реак­ции нейтрализации.

А Демонстрация

1. Диагностические препараты для выявления антител (диагностикумы).

А Задание студентам

1. Протоколировать и оценить результаты развернутой реакции агглютинации, поставленной с целью опре­деления титра специфических антител в исследуемой сыворотке.

2. Протоколировать и оценить результаты РИГА, постав­ленной с целью серодиагностики.

3. Протоколировать и оценить результаты реакции преци­питации в геле, поставленной с целью серодиагностики.

4. Протоколировать и оценить результаты титрования ком­племента с целью расчета рабочей дозы комплемента.

5. Протоколировать и оценить результаты реакции свя­зывания комплемента (РСК), поставленной с целью серодиагностики.

6. Протоколировать и оценить результаты реакции Кум-

бса, поставленной с целью определения титра непол­ных антител в исследуемой сыворотке.

7. Протоколировать и оценить результаты иммунофер-ментного анализа с целью выявления специфических антител в исследуемых сыворотках.

8. Протоколировать и оценить результаты реакции флок-куляции, поставленной с целью титрования антиток­сической сыворотки.

9. Протоколировать и оценить результаты антистрепто-лизиновой реакции, поставленной с целью серодиаг­ностики ревматизма.

10. Протоколировать и оценить результаты РТГА, постав­
ленной с целью серодиагностики вирусной инфекции.
Сделать заключение по результатам каждой серологи­
ческой реакции.

Методические указания

Для приготовления сыворотки взятую из вены кровь в коли­честве 3—4 мл помещают в термостат при 37 °С на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробир­ки стеклянной палочкой и выдерживают при 4 °С в течение часа для лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сы­воротки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой.

1. Радиоиммунный метод.Количество специфических анти­тел в исследуемом образце можно определить, используя вари­ант конкурентного связывания: по их способности ингибиро-вать связывание радиоактивно меченных антител со специфи­ческим антигеном, фиксированным на твердой фазе. Но чаще используют метод выявления связавшихся с антигеном на твер­дой фазе специфических антител с помощью радиоактивно меченных антииммуноглобулиновых антител, специфичных к константной области молекулы иммуноглобулина. Проще все­го получить антииммуноглобулиновую сыворотку путем имму­низации животных одного вида иммуноглобулинами живот­ного другого вида. Такая антииммуноглобулиновая сыворотка будет связывать любые молекулы иммуноглобулинов соответ­ствующего вида (мышей, кроликов или других видов). Такую меченную радионуклидами антииммуноглобулиновую сыво­ротку против иммуноглобулинов человека используют в РИА для выявления связывания немеченых человеческих антител на фиксированном антигене. Эта антииммуноглобулиновая сыво­ротка "распознает" антитела разной специфичности, связыва­ясь с антигенными эпитопами в константной части молекул. Используя РИА или ИФА, можно определить не только количество антигенспецифических антител, но и принадлеж­ность этих антител к тому или иному изотипу иммуноглобули­нов. Для этого используют антииммуноглобулиновые антитела, специфичные для отдельных изотипов иммуноглобулинов. По-

лучение таких антииммуноглобулиновых антител начинается с иммунизации животного очищенным препаратом одного из изотипов иммуноглобулинов. Из полученной иммунной сыво­ротки путем многократной абсорбции удаляют все антитела, перекрестно реагирующие с иммуноглобулинами других изо­типов. Полученные антиизотипические антитела используют для определения количества антител каждого из изотипов в иммунной сыворотке, реагирующей с антигеном. Особая роль отводится антителам против IgE, которые позволяют опреде­лить количество иммуноглобулинов этого изотипа и специфи­ческих антител, относящихся к этому изотипу, при лаборатор­ной диагностике аллергических реакций анафилактического типа и атопических заболеваний.

2. Иммуноферментный анализ.Одним из наиболее чувстви­тельных методов выявления антител считается ИФА, который не уступает по чувствительности РИА и в то же время отлича­ется от него большей доступностью для обычных диагности­ческих лабораторий. Специфический антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола (поливинил-хлорида). Фиксированный на пластине антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавшихся белков связанные иммобилизованными ан­тигенами иммуноглобулины выявляют с помощью антивидо-вой (античеловеческой) антииммуноглобулиновой сыворотки, меченной ферментом пероксидазой. После инкубации с суб­стратом (пероксидом водорода) и индикатором оценивают фер­ментативную активность по интенсивности окраски. Интен­сивность окраски, пропорциональную количеству сорбирован­ных на антигене антител, можно оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выяв­лять антитела к разным антигенам.

3. Иммуноэлектрофорез.Для выявления антител, специфи­ческих по отношению к отдельным антигенным компонентам в составе сложной смеси, например к отдельным антигенам микроорганизмов, приходится прибегать к методам выделения белков из смеси. Одним из наиболее популярных методов выделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), который получил сокращенное обозначение: SDS-PAGE. Бел­ковые фракции распределяются в геле в соответствии с их размерами. После этого разделенные в электрофоретическом поле белки переносят на нитроцеллюлярную пластину, где они обрабатываются специфической антисывороткой. Положение белков, с которыми связываются специфические антитела, вы­является с помощью антииммуноглобулиновых антител, ме­ченных ферментом или радионуклидом. Этот метод получил название Western blot и используется в качестве уточняющего

при выявлении в сыворотке крови антител против вируса им­мунодефицита человека. Для этого белки вируса разделяют с помощью SDS-PAGE, разделенные белки переносят на плас­тину нитроцеллюлозы и проводят инкубацию с испытуемой сывороткой. Антитела из сыворотки связываются с разными антигенными фракциями, что выявляется с помощью фер-ментно-меченой антииммуноглобулиновой сыворотки против иммуноглобулинов человека.

4. Иммунофлюоресцентный метод.Используется, например, в серодиагностике сифилиса. Мазок из взвеси T.pallidum на стекле обрабатывают исследуемой сывороткой, в которой по­дозревается присутствие специфических антител. Если в сыво­ротке имеются антитела против антигенов спирохеты, они свя­зываются с микробом. Избыток антител удаляют отмыванием. Мазок дополнительно обрабатывают флюоресцирующей сыво­роткой против человеческих иммуноглобулинов. О выявлении специфических антител в исследуемой сыворотке будет свиде­тельствовать обнаружение светящихся спирохет при люмине­сцентной микроскопии мазка.

Аналогичным методом выявляют антинуклеарные антитела (антитела против ДНК) в сыворотке крови при ряде аутоим­мунных заболеваний, используя в качестве антигена ядерные клетки животного происхождения.

5. Реакция развернутой агглютинации.Сначала готовят ос­новное разведение сыворотки, из которого делают серию раз­ведений путем последовательного переноса 1 мл из предыду­щей пробирки в следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль анти­гена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контроль­ную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последователь­но каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не долж­но быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следу­ющими знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агг-лютината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — непол­ная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости), "++" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жид­кость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная) (рис.

10.2.1).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в

котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем "++".