Антимикробное действие антибиотиков

Антибиотики - это очишенные высокоактивные биологические препараты микробного, животного и растительного или биотехнологического происхождения, предназначенные для биоцидного или биостатического действия на рост и размножение чувствительных к ним микробов.

Антибиотики - это особые биологические вещества, продуцируемые некоторыми видами микроорганизмов и другими живыми организмами, способные в малых дозах убивать или задерживать рост микробов. Каждый из антибиотиков имеет определенный спектр действия, очерченный кругом чувствительных к ним микроорганизмов. Антимикробную активность антибиотиков выражают в единицах действия - ED, которая обычно, составляет 1 мкг химически чистого препарата, за исключением пенициллина (0,6 мкг), нистатина (0,3 мкг), полимиксина (0,1 мкг).

Резистентность бактерий – это следствие хромосомных или R-плазмидных генетических превращений. Видовая резистентность микробов определяется хромосомными генами. Так, Грам (+) бактерии малочувствительны к пенициллинам, т.к. они плохо проникают через наружную мембрану (кроме нейссериевых).У синегнойной палочки - это результат толстого слоя слизи. Бактерии могут быть лишены атакуемой, например, пенициллинами, мишени - отсутствие у микоплазм и L-форм бактерий клеточной стенки. На анаэробы не действуют аминогликозиды. а на аэробы не действует митронидазол и пр.

Штаммовая резистентность (R-плазмиды, транспозоны) микроорганизмов определяется быстротой распространения подвижных генов внутри популяции или вида. В этом случае антибиотики действуют как селекционирующий фактор - в его присутствии выживают лишь резистентные штаммы.

Чувствительность микробов к антибактериальному действию определяют методами диско-диффузионным или разведений антибиотиков.

1. Диско-диффузионный метод

Используют стандартные среды: АГВ № 1 и № 2 (отечественные), агар Miller-Hinon 2.

Cтандартные диски с антибиотиками промышленного производства используют до окончания их срока годности.

На поверхность подсушенной питательной среды в чашках Петри наносят 1 мл исследуемой бульонной культуры (18-24 ч роста) которую равномерно распределяют по чашке. Избыток культуры удаляют отсасыванием пипетками.

Чашки подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре.

Диски с антибиотиками накладывают пинцетом (на расстояния 2 см от края чашки, не более 6 дисков на чашку). При возможности используют для наложения дисков устройство - диспенсер. Чашки ставят вверх дном в термостат и инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч.

Для учета результатов чашки помещают кверху дном на матовую поверхность, которую освещают под углом 45⁰. С помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, с точностью измерения до 1 мм. Диаметр зон измеряют по четкому контуру.

2. Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, которая может ингибировать рост исследуемой культуры бактерий.

Готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг на 1 мл или ED на 1 мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из раствора делают 7 последовательных разведений в пробирках в объеме 1 мл на бульоне. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл исследуемой бактериальной культуры, содержащей 10⁶-10⁷ бактериальных клеток в 1мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл культуры (контроль посева). Посевы инкубируют при 37⁰ С до следующего дня, после чего отмечают результаты, сравнивая степень помутнения бульона во всех пробирках с контролем.

Последняя пробирка с прозрачным содержимым указывает на задержку роста микробов под действием минимальной ингибирующей дозы антибиотика. Оценку чувствительности микробов проводят по таблице № 11.

Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется концентрациями, антибиотиков, создаваемыми в организме людей при использовании предельно-допустимых доз. Соответственно чувствительными являются штаммы микробов, рост которых подавляют концентрации препаратов, обнаруживаемые в сыворотке больного, используя обычные дозы антибиотиков. Для определения антибиотикочувствительности следует делать разведения антибиотиков, согласно таблицы № 12

Определение антибиотика в крови у человека. В штатив устанавливают 2 ряда пробирок. В одном ряду делают последовательные разведения эталонного антибиотика, а в другом - исследуемой жидкости (крови). В каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, которые были приготовлены в среде Хисса с глюкозой.

В качестве тест-бактерий используют S.aureus (определение пенициллина, тетрациклина, эритромицина) и E.coli для определения стрептомицина. После инкубации посева при 37^о С

в течение 18-24 ч отмечают рост культуры по помутнению среды и ее окрашиванию (таблица № 11 и 12).

Таблица № 11.

Антибиотики	Метод диска. Диаметр зон задержки роста в мм на среде АГВ	Метод серийных разведений, МИК мкг на 1 мл
	устойчивые	умерено устойчивые	чувствительные	устойчивые	чувствительные
Бнзпенициллин- стафилококки		21-28		-	0,1
Ампициллин- стафилококки		21-28		-	1,5
Карбенициллин-эшерихии		15-18
Метициллин		14-18		-
Оксациллин		16-19		-
Стрептомицин		17-19
Тетрациклин		17-20
Эритромицин		18-21

Таблица № 12.

Номер пробирки	Разведение анти- биотика в пробирке	Концентрация анти- биотика, мкг 1 мл	Доза исследуемой культуры	Рост бактерий, помутнение среды
	1: 100		0,1	-
	1: 200		0,1	-
	1: 400		0,1	-
	1: 800	12,5	0,1	-
	1: 1600	6,25	0,1	+
	1: 3200	3,12	0,1	+
	Без антибиотика		0,1	+ контроль

В качестве тест-бактерий используют S.aureus (определение пенициллина, тетрациклина, эритромицина) и E.coli для определения стрептомицина. После инкубации посева при 37^о С в течение 18-24 ч отмечают рост культуры по помутнению среды и ее окрашиванию.

Если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост S.aureus, например, было 1:800, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, которая могла задерживать рост этого микроба 0,220 мкг в 1 мл, то произведение 800х0,220 = 176 мкг в 1 мл, составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.