Темы для реферативных сообщений

Методы определения активности ферментов, и методы выражения активности ферментов.

Приложение для студентов лечебного и педиатрического факультетов

Лабораторная диагностика

Для исследования активности энзимов чаще всего используется плазма или сыворотка крови. В процессе свертывания крови и последующей ретракции кровяного сгустка высвобождаются биологически активные вещества тромбоцитов, под влиянием которых возрастает активность многих ферментов. Разрушение форменных элементов крови (эритроцитов) обусловливает дальнейшее повышение их активности. Поэтому, например, при исследовании лактатдегидрогеназы (ЛДГ) рекомендуется не допускать гемолиза. Хранение сыворотки сопровождается снижением функциональной способности энзимов. Для большинства из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение 6-8 часов. Известно, что многие антикоагулянты изменяют деятельность ферментов. Установлено, что оксалаты подавляют активность ЛДГ, а салицилаты, наоборот, повышают работу аминотрансфераз.

В клинико-диагностических лабораториях методы определения активности ферментов могут быть разделены на две основные группы:

а) состоящие в определении конечного продукта, образовавшегося после известного периода инкубации ферментного препарата (обычно сыворотки) с субстратом в соответствующем буфере. Выполняется путём измерения опытной и контрольной проб. Для этого используется специальная химическая реакция, и учет оптической плотности может быть произведён на обычном фотоэлектроколориметре или на специальных лабораторных анализаторах.

б) методы, с помощью которых в ходе ферментативной реакции непрерывно или периодически определяют потребление субстрата, кофермента или образование метаболита. Это чаще всего используется в экспериментальных лабораториях.

Активность ферментов выражается количеством разрушенного субстрата или образованного в ходе реакции продукта (в моль, ммоль, мкмоль) в пересчёте на один литр сыворотки (плазмы) крови при температуре 37, 30, 25˚С (SI), либо в международных единицах (Е/л, U/l), а также в каталах (долях катала) на литр, например, мккат/л. Одна единица (U) какого-либо энзима есть то его количество, которое катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата за 1 мин при определенных условиях.

Ферментативный состав биологических субстратов.

Клетка - сложнофункциональная система, регулирующая своё жизнеобеспечение. Многообразие функций клетки обеспечивается пространственной регуляцией определённых метаболических путей. Пространственная регуляция связана со строгой локализацией определённых ферментов в различных органеллах. Так, в ядре находятся ферменты, связанные с синтезом молекул ДНК и РНК, в цитоплазме - ферменты гликолиза, в лизосомах - гидролитические ферменты, в матриксе митохондрий - ферменты ЦТК, во внутренней мембране митохондрий - ферменты цепи переноса электронов и т.д.

Такая субклеточная локализация ферментов способствует упорядоченности биохимических процессов и увеличивает скорость обмена веществ.

Митохондрии

Внешняя мембрана митохондрий – играет разграничительную роль, в ней содержатся ферменты удлинения насыщенных жирных кислот, МАО (маркерный фермент) и др.

Межмембранное пространство (ММП) – содержит аденилатциклазу и нуклеозиддифосфаткиназу).

Внутренняя мембрана содержит ферменты тканевого дыхания. Маркерный фермент цитохромоксидаза.

Матрикс (М) содержит ферменты ЦТК, β-окисления жирных кислот, декарбоксилирования альфа–кетокислот. Дыхательня цепь – это система ферментов и коферментов, которые принимают участие в транспорте электронов и протонов от окисляемого субстрата к кислороду.

Лизосомы.Это - структуры в клетках, содержащие ферменты, способные расщеплять (т.е. лизировать — отсюда и название) белки, полисахариды, пептиды, нуклеиновые кислоты. Основная их роль — участие в процессах внутриклеточного расщепления как экзогенных, так и эндогенных биологических макромолекул. Характерной чертой лизосом является то, что они содержат около 40 гидролитических ферментов: протеазы, нуклеазы, фосфатазы, гликозидазы и др., оптимум действия которых осуществляется при рН 5. В лизосомах кислое значение среды создается из-за наличия в их мембранах протоновой «помпы», потребляющей энергию АТФ. Кроме того, в мембраны лизосом встроены белки-переносчики для транспорта из лизосомы в цитоплазму продуктов гидролиза: мономеров расщепленных молекул — аминокислот, сахаров, нуклеотидов, липидов. Чтобы не переварить самих себя, мембранные элементы лизосом защищены олигосахаридами, мешающими гидролазам взаимодействовать с ними. Функция лизосом - обеспечение внутриклеточного пищеварения, то есть расщепления как экзогенных, так и эндогенных веществ.

Пероксисомы– сходны по строению с лизосомами, однако отличаются от них тем, что в их матриксе содержится каталаза - фермент, разрушающий перекись водорода, образующуюся при окислении аминокислот.

Органоспецифичность.В процессе развития от оплодотворенного яйца до взрослого организма различные ферментные системы синтезируются неодновременно, поэтому с возрастом ферментный состав тканей изменяется. Возрастные изменения метаболической активности особенно выражены в период эмбрионального развития по мере дифференцировки различных тканей с их характерным набором ферментов. На самых ранних стадиях развития эмбриона (непосредственно после оплодотворения яйцеклетки) преобладают те типы ферментов.которые транслируются с материнского генетического материала. В печени выявлены 3 основные группы ферментов, появляющиеся в позднем внутриутробном периоде, в периоде новорожденности и в конце периода грудного вскармливания.

Ферментный состав различных клеток неодинаков. Ферменты, выполняющие функцию жизнеобеспечения клетки, находятся во всех клетках организма. В процессе дифференцировки клеток происходит изменение ферментного состава клеток. Так, фермент аргиназа, участвующий в синтезе мочевины, находится только в клетках печени, а кислая фосфатаза, участвующая в гидролизе моноэфиров ортофосфорной кислоты - в клетках простаты. Это так называемые органоспецифичные ферменты.

Если говорить об узко специализированных клетках, то ферментов, выполняющих функции в этих клетках, находится больше, чем в других клетках. Например, в клетках сердечной мышцы имеется повышенное количество ферментов креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы, в клетках печени - аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, в остеобластах - щелочной фосфатазы и т.д.

Внутриклеточная локализация ферментов.

Энзимопатия - заболевания, в основе которого лежат генетические и др. изменения активности ферментов.

По классификации академика Покровского энзимопатиии делятся на:

1) наследственные (генетически детерминированы - точечные мутации, хромосомные аберрации) фенилкетонурия, галактоземия, альбинизм);

2) алиментарные - связаны с пищевыми факторами: дефицит белка, микроэлементов, гипо- и авитоминозы, несбалансированное питание. Употребление недоброкачественной пищи (красители, консерванты);

3) токсические - связаны с ингибированием ферментов пестицидами, гербицидами, лекарствами, выбросами машин, заводов (например тетрациклин блокирует рибосомальный цикл гепатоцитов в печени).

По современной классификации:

1) первичные (врожденные, наследственные);

Точечные мутации гена, кодируюшего фермент.

Наличие ингибитора или отсутствие активатора при синтезе фермента.

Генетические дефекты синтеза кофермента.

Нарушение процессинга белка.

Патология или отсутствие матрицы ДНК и РНК

2) вторичные (приобретенные: алиментарные и токсические).

Нарушения энергообеспечения (уменьшение АТФ, ГТФ - нарушение синтеза

апофермента).

Недостаток аминокислот (белковое голодание).

Отсутствие или недостаток кофермента: витаминов, микроэлементов, нарушение

ресорбции витаминов в ЖКТ.

Все причины гиповитаминозов.

Клеточная деструкция разного генеза.

Все инфекционные болезни (вирусные, бактериальные и паразитарные) протекают с расстройством ферментных систем, это связано с выделением экзо- и эндотоксинов, блокирующих ряд ферментов.

Другой причиной является гипо- и гиперфункция эндокринных желез.

Также причиной может быть резкое изменение условий среды, в которой работает фермент. (Ацидоз или алколоз).

Первичные энзимопатии

Наследственные ферментопатии. Генетически детерминированные нарушения обмена веществ. Ферментопатии лежат в основе многих наследственных болезней. При этом может полностью отсутствовать ген, контролирующий синтез белковой молекулы фермента (апофермента), либо апофермент синтезируется, но активность фермента отсутствует или резко снижена. В результате генных мутаций может изменяться последовательность аминокислот в структуре активного центра фермента или в регионе связывания апофермента с коферментом (чаще всего витамином или металлом). Кроме того, могут синтезироваться нестабильные легко распадающиеся молекулы ферментов. Все эти изменения структуры белков-ферментов называют молекулярными болезнями, или молекулярной патологией. Известно более 150 наследственных ферментопатий, для которых установлена сущность генной мутации, определены ошибки в синтезе белковой молекулы фермента, а соответствующие мутантные гены картированы на хромосомах (т.е. установлена их локализация на одной из 22 аутосом или Х-хромосоме). Примерно 75% генных мутаций представляют собой замену оснований в молекуле ДНК, что приводит к изменению генетического кода и соответственно к замене одной аминокислоты на другую в полипептидной цепи фермента.

Выпадение каталитической функции фермента создает метаболический блок соответствующей биохимической реакции. Патологические проявления блока могут быть связаны с накоплением веществ, образующихся до блока, или с дефицитом продуктов реакции, которые обычно синтезируются в результате воздействия фермента.

Существует большая группа ферментопатий, получивших название болезней накопления, или тезаурисмозов, при которых вещества — предшественники реакции депонируются в клетках (например, гликоген при гликогенозах, гликопротеины, гликолипиды при ряде лизосомных болезней, мукополисахариды при мукополисахаридозах). Многие патологические состояния обусловлены дефицитом конечных продуктов реакции, приводящих к снижению биосинтеза гормонов (врожденная дисфункция коры надпочечников, гипотиреоз, гипопаратиреоз и др.). Соединения, накапливающиеся до метаболического блока,нередко становятся токсичными в результате их преобразования в обходных биохимических реакциях.

Ферментопатии могут быть связаны с патологическими изменениями клеточных рецепторов. Так, наследственная недостаточность мембранных рецепторов липопротеинов низкой плотности приводит к нарушению регулирования активности ферментов синтеза холестерина и гиперхолестеринемии. Некоторые ферментопатии проявляются нарушениями активного мембранного транспорта (например, транспорта аминокислот и цистина при цистинурии, глюкозы при гликогеновой болезни, глюкуроновой кислоты при врожденной гипербилирубинемии).

По принципу ведущих нарушений обмена веществ наследственные ферментопатии разделяют на следующие типы:

I. ферментопатии обмена аминокислот (алкаптонурия, альбинизм, гипервалинемия, гистидинемия, гомоцистинурия, гиперлизинемия, лейциноз, тирозиноз, фенилкетонурия, цистатионинурия, цистиноз);

II. обмена углеводов (галактоземия, гликогенозы, лактат-ацидоз, непереносимость фруктозы);

III. обмена липидов (липидозы) — плазматические (наследственная гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, недостаточность лецитин-холестеринацилтрансферазы) и клеточные (ганглиозидозы, муколипидозы, сфингомиелинозы, цереброзидозы); \

IV. обмена пуринов и пиримидинов (подагра, синдром Леша — Найхана, оротовая ацидурия);

V. биосинтеза кортикостероидов (адреногенитальный синдром, гипоальдостеронизм);

VI. порфиринового (порфирии) и билирубинового) обмена);

VII. соединительной ткани (Марфана синдром, Элерса — Данлоса синдром)',

VIII. обмена металлов — гепатоцеребральная дистрофия и болезнь Менкеса (обмен меди), гемохроматоз (обмен железа), семейный периодический паралич (обмен калия);

IX. ферментопатии эритрона — гемолитические анемии, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глютатионредуктазы в эритроцитах, анемия Фанкони (недостаточность супероксиддисмутазы);

X. ферментопатии лимфоцитов и лейкоцитов — иммунодефицитные состояния при недостаточности аденозин-деаминазы, пурин-нуклеотид-фосфорилазы, септический гранулематоз;

XI. ферментопатии транспортных систем почек (тубулопатии) — почечный канальцевый ацидоз, болезнь де Тони — Дебре — Фанкони, фосфат-диабет, XII. ферментопатии желудочно-кишечного тракта — мальабсорбции синдром при недостаточности дисахаридаз, патология кишечного транспорта глюкозы и галактозы, врожденная хлоридная диарея.

Первичные энзимопатии связаны с генетически обусловленной недостаточностью одного или нескольких ферментов. При этом дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомно-рецессивному типу. Гетерозиготы, как правило, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии относят к метаболическим болезням, так как происходят нарушения определенных метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из трех ниже перечисленных вариантов.

Вторичные энзимопатии

Вторичные энзимопатии являются следствием тех или иных патологических процессов, сопровождающихся нарушением активности ферментов. Они наблюдаются при многих заболеваниях. Так, например, причиной развития вторичной лактазной недостаточности могут являться: кишечные инфекции вирусной и бактериальной этиологии, паразитарные заболевания (лямблиоз и др.), синдром короткой кишки (пострезекционный), целиакия, токсическое и лекарственное поражения кишечника (на фоне лучевой и химиотерапии, антибиотикотерапии).

Одним из вариантов вторичных энзимопатий являются алиментарные энзимопатии – патологические состояния, обусловленные стойкими нарушениями активности ферментов в связи с характером питания. Алиментарные энзимопатии могут быть обусловлены длительным дефицитом белка в питании (например при квашиоркоре), нарушением биосинтеза коферментов при витаминной недостаточности, угнетением синтеза металлоферментов при низком содержании в рационе соответствующих минеральных веществ. Кроме того, они могут возникать при несбалансированном питании в целом. К развитию алиментарных энзимопатий может приводить также нарушение поступления пищевых веществ из желудочно-кишечного тракта в кровь при длительных поносах, атрофии или поражении слизистой оболочки кишечника и др. К алиментарным энзимопатиям относят и так называемые токсические энзимопатии, связанные с угнетением активности или биосинтеза отдельных ферментов различными естественными компонентами пищевых продуктов (ингибиторы протеолитических ферментов, антивитамины и др.) или чужеродными веществами (например пестицидами), содержащимися в них.

Клинические проявления приобретенных энзимопатий зависят от вида фермента, функция которого нарушена и характеризуется нарушениями того или иного вида обмена веществ.

Разработаны методы дородовой диагностики наследственных ферментопатий (антенатальная диагностика), которая основана на определении активности ферментов в клетках хориона или амниотической жидкости, полученной при амниоцентезе на 16-й неделе беременности. Методы генно-инженерной диагностики ферментопатий охватывают все более широкий перечень заболеваний и в ближайшем будущем займут ведущее место, хотя и не исключают необходимость исследования активности ферментов биохимическими приемами.

В последние годы стали известны нормальные вариации активности ферментов, участвующих в инактивации токсических продуктов как экзогенных, так и образующихся в процессе обмена веществ. Эти вариации наследуются в соответствии с законами Менделя и определяют существование в популяции фенотипов быстрых и медленных инактиваторов. Они установлены для таких ферментов, как арилуглеводород-гидроксилаза (скорость окисления полициклических углеводородов), параоксоназа (гидролиз фосфоорганических пестицидов), семейство цитохром Р-450-оксидаз (чувствительность организма к действию многих лекарственных препаратов), трансфераза глюкуроновой кислоты (гликозилирование эндогенных и экзогенных соединений) и ряда др. Такие генетически детерминированные варианты ферментативной активности изучают экогенетика и фармакогенетика человека.