Раздел iv. энергетический обмен

Занятие № 9

ТЕМА. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОНОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГОВ.

Цель занятия: 1.Сформировать знания о биологическом окисле

нии как источнике энергии в живых системах.

2.Усвоить структуру и биологическую роль макроэргов, ды-

хательных ферментов и их коферментов.

3.Познакомиться с методикой определения макроэргов.

Исходный уровень знаний:

- понятие об обмене веществ, его составных частях;

- связь обмена веществ с обменом энергии;

- строение клетки, роль митохондрий;

- химическая природа ферментов;

- коферментная функция витаминов.

Содержание занятия.

I.2. Основные этапы обмена веществ.

Соотношение понятий метаболизм, анаболизм, катаболизм.

Общие понятия о метаболических путях и энергетическом

обмене.

Биологическое окисление и тканевое дыхание.

Дегидрирование субстратов как источник энергии для синтеза АТФ.

Состав цепи переноса электронов и протонов при окислении субстратов.

Роль витаминов в тканевом дыхании.

Структура и функция коферментов дегидрогеназ.

Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРО-

ЭРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЦ (АТФ И КРЕАТИНФОСФАТА)

АТФ и креатинфосфат являются основными макроэргами мышечной ткани. АТФ синтезируется главным образом в процессе окислительного фосфорилирования, а креатинфосфат – при участии АТФ в состоянии мышечного покоя. При активной работе мышц креатинфосфат дает энергию для синтеза АТФ из АДФ.

Принцип метода.

Фосфатные остатки АТФ и креатинфосфата легко отщепляются при кислотном гидролизе (т.н. лабильно связанный фосфор). Сравнивают содержание неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Порядок выполнения работы.

В пробирку внести 0,5 г мышечной кашицы, поместить на ледяную баню и добавить 5 мл охлажденного раствора ТХУ. Содержимое пробирки помешивать стеклянной палочкой в течение 5 мин. Экстракт профильтровать в мерную пробирку, стоящую на ледяной бане. Остаток кашицы залить дистиллированной водой (5 мл), через 5 мин. профильтровать в ту же мерную пробирку и довести объем фильтрата до 10 мл, добавив дистиллят.

Реагенты	Пробирки
Опытная	Контрольная
Безбелковый фильтрат	0,5	0,5
1М раствор HCl	1.0	1,0
	Закрыть фольгой и кипятить 10 мин. на бане, охладить
1M раствор NaOH	1.0	1.0
Дистиллированная вода	7,5	7,5
Перенести из обеих пробирок в другие пробирки по 5 мл и добавить
Раствор молибдата аммония	0,5	0,5
Аскорбиновая кислота	0,5	0,5
Дистиллированная вода	2,0	2,0
Перемешать, оставить при комнатной температуре на 10 мин., колориметрировать на ФЭКе против воды, длина волны 670 нм.

Расчет. Определить разницу между оптической плотностью опытной пробы и контрольной. По калибровочному графику найти концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора (А) в пробе.

Х = А ∙ ( 3,3 ∙ 400 ) ∙ 100, где

Х – содержание макроэргов в мг/100г (мг%),

А – содержание АТФ в пробе.

3,3 ∙ 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2.Контрольные вопросы.

Что такое макроэрги? Приведите примеры.

Какие пути образования АТФ вы знаете?

Где и когда образуется креатинфосфат?

Какова биологическая роль креатинфосфата?

Материал для самоподготовки: I а)I. с.305–311; II; III.

Занятие № 10.

ТЕМА. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.

РЕГУЛЯЦИЯ ЦЕПИ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ

(ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ).

Цель занятия: Получить представления о сопряжении биологического окисления с катаболическими и анаболическими процессами в клетке, этапах синтеза макроэргов в дыхательной цепи, значении и механизме регуляции окислительного фосфофорилирования.

Исходный уровень знаний:

- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса

обмена веществ;

- состав дыхательной цепи электронов;

- структура и функция дегидрогеназ.

Содержание занятия.

I.2. Строение митохондрий.

Этапы синтеза АТФ в цепи дыхательных ферментов при окислительном фосфорилировании. Коэффициент Р/О.

Субстратное фосфорилирование, его энергетическая ценность.

Разобщение дыхания и фосфорилирования.

Регуляция тканевого дыхания.

Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) - "фокус", в котором сходятся все метаболические пути.

II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТ-

ДЕГИДРОГЕНАЗЫ МЫШЦ И КОНКУРЕНТНОЕ

ТОРМОЖЕНИЕ ЕЁ АКТИВНОСТИ

Принцип метода и химизм реакции.

Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление (дегидрирование) янтарной кислоты в фумаровую. Коферментом служит флавинадениндинуклеотид (ФАД). В качестве акцептора водорода используется окисленная форма 2,6-дихлорфенол-индофенола (его натриевой соли), водный раствор которого окрашен в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения бесцветна. Источником фермента служит мышечная кашица. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназы вызывает малоновая кислота (НООС-СН₂-СООН), являющаяся структурным аналогом янтарной кислоты.

Cl

|

HOOC-CH₂-CH₂-COOH + O= =N– –ONa

сукцинат | сукцинат-

Cl дегидрогеназа

Cl

|

HOOC-CH=CH-COOH + HO– –NH– –ONa

фумарат |

Cl

Порядок выполнения работы.

Свежую мышечную ткань (около 1 г) измельчить ножницами и растереть в ступке с небольшим количеством воды (2-3 мл) в течение 1 минуты. Затем мышечную кашицу перенести на двойной слой марли, помещенной на воронку, промыть водой, переложить на фильтровальную бумагу и осушить.

Реагенты	Пробирки
опытная	опытная	контроль
Фосфатный буфер (рН 7,4)	3 мл	3 мл	3 мл
Мышечная кашица	0,1 г	0,1 г	0,1 г
3% раствор янтарной кислоты	5 кап.	5 кап.	-
0,1 N раствор NаОН	5 кап.	5 кап.	-
дистиллированная Н2О	-	-	10 кап.
3% раствор малоновой кислоты	-	5 кап.	-
0,001 N раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола	1 мл	1 мл	1 мл
Поместить в термостат при 370С на 40 минут
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

III.2.Контрольные вопросы.

Какую реакцию катализирует сукцинатдегидрогеназа?

Что является коферментом сукцинатдегидрогеназы?

Что является структурным аналогом янтарной кислоты, вызывающим конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназы?

Материал для самоподготовки: I а)1. с.311-313, 345-353; II; III.

Занятие № 11.

ТЕМА. МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ.

КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ. ОПРЕ-

ДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

Цель занятия: 1.Получить представления об особенностях микросомального окисления, компонентах монооксигеназной цепи, биологическом значении гидроксилирования субстратов, антиоксидантах.

2.Овладеть методикой определения фермента каталазы.

Исходный уровень знаний:

- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса

обмена веществ;

- представления о окислительном фосфорилировании;

- строение клетки, микросомы;

- оксидоредуктазы.

Содержание занятия.

I.2. Состав микросомной фракции, выделяемой из клеток.

Особенности строения монооксигеназ (гидроксилаз).

Роль микросомального окисления в метаболизме регуляторных молекул, ксенобиотиков.

Антиоксидантная роль витаминов С и Е.

Понятие о пероксисомальном окислении.

Роль пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы.

II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КАТАЛАЗУ

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода на молекулярный кислород и воду.

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

каталаза

Принцип метода.

Фермент каталаза содержит гем. В процессе разрушения перекиси водорода происходит окисление и восстановление железа, входящего в состав фермента.

Порядок выполнения работы:

Реактивы	Контрольная пробирка	Опытная пробирка
Н2О (мл)
Кровь (кап)
Кипятить 2-3 мин, затем охладить
3% раствор Н2О2 (кап)	5-10	5-10
Встряхнуть
РЕЗУЛЬТАТЫ:

Работа № 2.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

КАТАЛАЗЫ (ПО БАХУ И ЗУБКОВОЙ).

Принцип метода. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:

2KMnO₄+5H₂O₂+4H₂SO₄ 2MnSO₄+8H₂O+5O₂+2KHSO₄

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом (КЧ) называют количество миллиграммов Н₂О₂, которое разлагается в 1 мкл крови. О количестве расщепленной Н₂О₂ судят по разности объема раствора KMnO₄, израсходованного до и после действия каталазы.

Порядок выполнения работы:

Приготовление раствора крови. В мерную колбу вместимостью 100 мл налить около 10 мл дистиллированной Н₂О, затем внести микропипеткой 0,1 мл крови. Микропипетку промыть три раза водой из колбы. Долить водой до метки, чтобы кровь была разведена в 1000 раз (1 мл раствора содержит 1 мкл крови)

Реактивы (мл)	Опытная колба	Контрольная колба
Н2О
Кровь, разведенная 1:1000
1% раствор Н2О2		-
10% раствор Н2SO4	-
Примечание. Действие каталазы прекращается в кислой среде, т.к. она действует при рН 7,4 Инкубация 30 минут при комнатной температуре
10% раствор H2SO4		-
1% раствор Н2О2	-

Титрование 0,1 N раствором KMnO₄ до розовой окраски.

КЧ = (А - В) ∙ 1,7

где: А - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование контрольной пробы;

В - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование опытной пробы.

Полученную разность умножают на 1,7 (1 мл 0,1 N раствора KMnO₄ эквивалентен 1 мл 0,1 N Н₂О₂, в котором содержится 1,7 ммоль/л (1,7 мг) Н₂О₂, т.к. 1 моль/л Н₂О₂ равен 1,7 г.)

Клинико-диагностическое значение.

В норме каталазное число составляет 10-15 ед. При раке, анемии, туберкулезе содержание каталазы в крови снижается.

РЕЗУЛЬТАТЫ:	А =	В =
КЧ =

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

К какому классу ферментов относятся каталаза и пероксидаза?

В каких клетках наибольшее количество каталазы?

Какой субстрат является специфическим для каталазы?

Что такое каталазное число?

Чему в норме равно каталазное число?

Укажите диагностическое значение количественного определения каталазы крови.

Материал для самоподготовки: I а)1. с.313–318, 559

595-596; II; III.

Занятие № 12

КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ: "ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ. ОБЩИЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА"

Вопросы к коллоквиуму

1. Источники и пути использования энергии для различных организмов. Соотношение между понятиями энергетический обмен, биологическое окисление, тканевое дыхание.

2. Обмен веществ и энергии как основа жизни. Общие понятия о метаболических путях и энергетическом обмене.

3. Эндергонические и экзергонические реакции в живой клетке.

4. Макроэргические соединения - универсальные аккумуляторы энергии при метаболизме. Цикл АДФ↔АТФ. Основные пути фосфорилирования АДФ и использования АТФ.

5. Современное представление о биологическом окислении. Значение работ А.Н.Баха и В.И.Палладина.

6. Строение митохондрий и структурная организация цепи переноса электронов и протонов.

7. Дегидрирование субстратов и окисление водорода как источник энергии для синтеза АТФ. Характеристика дегидрогеназ.

8. Место в цепи дыхательных ферментов и значение пиридинзависимых дегидрогеназ, структура коферментов (окисленных и восстановленных форм). Важнейшие субстраты НАД-зависимых дегидрогеназ.

9. Место в цепи дыхательных ферментов и значение флавинзависимых дегидрогеназ, структура коферментов (окисленных и восстановленных форм). Важнейшие субстраты ФАД-зависимых дегидрогеназ.

10. Место в цепи дыхательных ферментов и значение убихинона (KoQ), химическая природа и роль в окислительных процессах.

11. Цитохромы, цитохромоксидаза, химическая природа и роль в окислительных процессах.

12. Свободное окисление, окислительное и субстратное фосфорилирование.

13. Этапы продукции макроэргов в цепи дыхательных ферментов. Коэффициент Р/О.

14. Регуляция переноса электронов (дыхательный контроль). Роль некоторых биологически активных и лекарственных веществ.

15. Разобщение дыхания и фосфорилирования, терморегуляторная функция тканевого дыхания.

16. Строение митохондрий. Избирательная проницаемость митохондриальной мембраны для субстратов, АДФ и АТФ.

17. Нарушения энергетического обмена и гипоксические состояния.

18. Витамины РР и В₂, убихинон. Роль в биологическом окислении.

19. Особенности микросомального и пероксисомального окисления. Роль токоферола и аскорбиновой кислоты в защите от токсического действия кислорода.

20. Цикл трикарбоновых кислот (последовательность реакций). Биологическое значение ЦТК.

21. Аллостерический механизм регуляции цикла лимонной кислоты (ЦТК).

22. Связь между общими путями катаболизма и цепью переноса электронов и протонов (на примере ЦТК).