Питательных сред, посуды, материалов и инструментов

Важнейшим условием проведения микробиологических работ является полное исключение развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах и материалах. С этой целью в микробиологической практике используют только стерильные питательные среды, посуду, материалы и инструменты. Под стерилизацией понимают полное уничтожение всех живых микроорганизмов.

Существуют физические и химические способы стерилизации.

Химические методы применяются при дезинфекции. Дезинфекция – это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильнодействующих химических веществ, так называемых антисептиков. К ним относятся неорганические кислоты, щелочи, хлорная известь, иод и др. Из органических веществ – этиловый и бутиловый спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители. В лабораторной практике химические методы применяют для обработки рабочего стола, рук, камеры для посевов, других предметов.

Широкое распространение при проведении микробиологических работ нашли физические способы. Физические способы стерилизации бывают термическими и холодными. К термическим относятся фламбирование, обработка горячим воздухом, тиндализация (или дробная стерилизация), обработка текучим паром, автоклавирование. К холодным – стерилизация фильтрованием, обработка ионизирующим и ультрафиолетовым излучениями, обработка ультразвуком (рис.3.5).

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими свойствами и химическим составом, целью исследования.

Фламбирование (или прокаливание в пламени горелки). Этим способом стерилизуют мелкие лабораторные инструменты, препаровальные иглы, бактериологические петли, пинцеты, скальпели, стеклянные палочки и т.п. После прокаливания предметы охлаждают, держа их так, чтобы они не касались других предметов, и тут же используют по назначению.

Стерилизация горячим воздухом (сухим жаром). Стерилизацию проводят в электросушильном шкафу. Применяют для стерилизации

Рис. 3.5. Способы стерилизации

стеклянной посуды, металлических и других термостойких предметов. Все стерилизуемые предметы предварительно аккуратно заворачивают в бумагу. Стерилизацию проводят при 165-180ºС в течение 2 час. Выше 180ºС температуру в сушильном шкафу не поднимают, так как ватные пробки и бумага начинают обугливаться. После остывания простерилизованную посуду и материалы вынимают из шкафа и хранят до использования в специально отведенном для этого шкафу.

Тиндализация (или дробная стерилизация). Применяется для стерилизации жидкостей и питательных сред, компоненты которых разлагаются при температуре выше 100ºС. При этом прогревание стерилизуемого объекта до 50-100ºС проводят не менее 3-х раз с промежутками в 15-24 час. В период между прогреваниями стерилизуемый объект выдерживают при температуре 18-30ºС для прорастания сохранившихся в нем спор микроорганизмов. Предполагается, что возникающие из спор вегетативные клетки погибают при последующем нагревании, не успев образовать новые споры.

Стерилизация текучим паром. Это прогревание жидкостей в парах кипящей воды. Обработку текучим паром проводят в течение 3-х дней по 30-40 мин ежедневно. Время прогревания отмечается с момента энергичного выделения пара. В промежутках между стерилизацией жидкости оставляют при 18-20ºС или выдерживают в термостате для проращивания спор.

Автоклавирование. Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации. Он основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного, т.е. при температуре выше 100ºС и осуществляется в специальных аппаратах – автоклавах. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность данного способа.

Автоклавы бывают разной конструкции и вместимости, но принцип их устройства одинаков (рис.3.6.).

Автоклав представляет собой металлический сосуд с двойными стенками, образующими водопаровую и стерилизационную камеры и способный выдерживать высокое давление. Внутренняя часть сосуда является стерилизационной камерой, в которую на специальной подставке помещают стерилизуемый материал. Стерилизационная камера окружена водопаровой камерой, в которую перед стерилизацией заливают дистиллированную воду. Камеры автоклава снабжены манометрами для контроля давления, Стерилизационная камера снабжена краном для выпуска воздуха и пара, предохранительным клапаном и краном, через который пар из водопаровой камеры поступает в стерилизационную камеру. После загрузки крышка автоклава герметично закрывается и прибор подключается в электросеть. После набора заданного давления в водопаровой камере открывают кран для доступа пара в стерилизационную камеру. При открытом в стерилизационной камере кране выпуска в течение 15-20 мин проводят вытеснение из нее воздуха перегретым паром, поступающим из водопаровой камеры. Необходимо, чтобы из автоклава был удален весь воздух, так как действие насыщенного перегретого пара на микроорганизмы значительно сильнее, чем его смеси с воздухом. После вытеснения воздуха закрывают выпускной кран и отмечают по манометру время достижения заданного давления в стерилизационной камере. С этого момента ведут отсчет требуемого времени стерилизации. По истечении времени стерилизации автоклав отключают от сети и очень осторожно приоткрывают выпускной клапан. При этом давление в обеих камерах автоклава медленно падает. Ни в коем случае нельзя допускать резкого падения давления, так как это приводит к бурному закипанию перегретых жидкостей и нарушению целостности упаковки стерилизуемых объектов. Открывать крышку автоклава можно лишь после снижения давления внутри автоклава до уровня атмосферного. Стерильный материал вынимают из автоклава и переносят в специально предназначенный для хранения стерильных предметов шкаф.

А Б

Рис.3.6. Схема устройства автоклава.

А - внешний вид вертикального автоклава;

Б – схема автоклава.

1 – стерилизационная камера; 2 – кран для выхода воздуха;

3 – манометр; 4 – предохранительный клапан; 5 – водопаровая камера;

6 – воронка для заполнения автоклава водой;

7 – клапан поступления пара в стерилизационную камеру;

8 – крышка автоклава; 9 – подставка для стерилизуемых предметов.

Температура и длительность автоклавирования определяются составом стерилизуемых жидкостей и питательных сред.

Мембранное фильтрование. Метод применяется в тех случаях, когда нагревание субстратов приводит к изменению их химического состава или разложению. Для удаления микроорганизмов жидкость фильтруют через специальные мелкопористые фильтры, изготовленные их коллодия, нитроцеллюлозы, ацетатцеллюлозы и других материалов. Фильтры представляют собой диски толщиной около 0,1 мм, диаметром 35 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются номерами от 1 до 5, например, фильтр № 1 имеет самые маленькие поры, средний диаметр которых равен 0,35 мм. Его обычно и используют для стерилизации. Мембранный фильтр закрепляется в специальном держателе, изготовленном из нержавеющей стали или стекла (рис. 3.7.).

А Б

Рис.3.7. Приборы мембранного фильтрования.

А – со стеклянным держателем;

Б – с металлическим держателем.

Держатель вставляется в приемник фильтрата ( например, в колбу Бунзена). Перед использованием фильтры, держатели и приемник фильтрата стерилизуются в автоклаве при 0,1МПа в течение 15-30 мин. Обычно применяют принудительное фильтрование, создавая перепад давления на фильтре откачиванием воздуха из приемника. Профильтрованную стерильную жидкость из приемника переливают в стерильную посуду и выдерживают 2-3 суток при 30ºС. Если в жидкости за это время обнаруживается рост микроорганизмов, то ее считают непригодной для дальнейшего использования.

Стерилизация излучением. Для уничтожения микроорганизмов в различных объектах можно применять ионизирующее, ультрафиолетовое и инфракрасное излучения. В силу разных причин (безопасности работы, наличия соответствующих установок, их стоимости и др.) наибольшее распространение получил метод с использованием ультрафиолетового излучения (УФ). УФ-излучение обладает невысокой проникающей способностью и поэтому его применяют для обработки воздуха в производственных помещениях и лабораториях, для обработки поверхностей различных материалов и тонких пленок неокрашенных прозрачных жидкостей. Для этих целей используют бактерицидные лампы с длиной волны излучения 250-260 нм. При стерилизации поверхностей лампы должны располагаться на высоте не более 0,4 м от обрабатываемого предмета. Для стерилизации воздуха в закрытых помещениях лампы располагают равномерно по периметру на высоте 2 м от пола из расчета 2-2,5 Вт/м³ объема. Ввиду неблагоприятного действия УФ-излучения на организм человека бактерицидные лампы включают только при отсутствии людей в помещении или используют лампы с закрытым генератором излучения и принудительной циркуляцией воздуха. Не пропускает ультрафиолетовое излучение обычное силикатное стекло.

Обработка ультразвуком (УЗ). Механические колебания с частотами выше 20 000 Гц (или 20 кГц) находятся за пределами человеческого восприятия и в отличие от обычных звуковых волн могут вызывать механическое разрушение микробных клеток. Летальное действие УЗ начинает проявляться при интенсивности 0,5 Вт/см² и частоте колебаний порядка десятков кГц. С повышением интенсивности УЗ и частоты колебаний эффект действия усиливается. Ультразвуковая обработка пока еще ограниченно применяется для стерилизации жидкостей, так как энергия волн не только вызывает гибель микроорганизмов, но и изменяет химический состав обрабатываемого субстрата. Кроме этого при работе с ультразвуковыми установками требуется соблюдение определенных правил безопасности.