Получение чистой культуры

Получение чистой культуры (ЧК) из сообщества микробных клеток очень трудоемкий и сложный процесс, включающий несколько стадий:

- получение накопительной культуры;

- выделение из накопительной культуры чистой культуры;

- проверка чистоты и идентификация выделенной чистой культуры.

Накопительная культура – это культура, состоящая из микроорганизмов со схожими физиологическими свойствами. Накопительную культуру получают при выделении чистой культуры микроорганизма из какого-либо материала или природного субстрата (например, воды, воздуха, почвы), в котором данный микроорганизм находится в небольшом количестве. Накопительную культуру получают в элективных условиях, способствующих развитию выделяемого микроорганизма и ограничивающих рост сопутствующих. Указанные условия можно создать путем использова­ния элективных сред. В результате накопительная культура будет содержать преимущественно клетки одного вида микроорганизма, так как элективные среды в сочетании с элективными условиями ограничивают развитие сопутствующих микроорганизмов. О получении накопительной культуры судят визуально, по появлению характерных признаков роста выделяемых микроорганизмов – помутнению среды, изменению цвета среды, появлению пленки, осадка, пузырьков газа. Помимо визуальной оценки, культуральную жидкость микроскопируют и выявляют присутствие выделяемых форм. В некоторых случаях о получении накопительной культуры свидетельствуют характерные химические изменения в составе среды, которые должны сопровождать процесс накопления выделяемых микроорганизмов. Это может быть образование аммиака, сероводорода и т.п.

После получения накопительной культуры приступают к выделению чистой культуры. Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или из одной клетки.

Получение чистой культуры из одной клетки производится капельным методом, с помощью микроманипулятора и с помощью микроселектора.

Капельный метод (метод Линднера) применим при работе с крупными микроорганизмами – дрожжами, мицелиальными грибами, водорослями. Для выделения готовят сильно разбавленные разведения накопительной культуры с таким расчетом, чтобы в небольшой капельке разведения были единичные клетки микроорганизмов. Затем на поверхность стерильного покровного стекла стерильной пастеровской пипеткой наносят ряд капель из этого разведения. Стекло с нанесенными каплями используют для приготовления препарата «висячая капля». Капли микроскопируют и отмечают те, где обнаружена только одна клетка. Затем препарат «висячая капля» переносят в чашку Петри и инкубируют в течение 12-24 час. После инкубации отмеченные капли снова микроскопируют и те, в которых произошло размножение, осторожно снимают с покровного стекла кусочком стерильной фильтровальной бумаги и бумагу переносят в пробирку с жидкой стерильной питательной средой.

При использовании микроманипулятора выделение единичных клеток из суспензии проводится под контролем микроскопа при помощи специальной микроскопической пипетки. Извлеченные клетки переносят в пробирки с жидкой питательной средой.

Микроселектор представляет собой стеклянный микрокапилляр с прямоугольным сечением, что позволяет хорошо просматривать его содержимое при микроскопировании с иммерсионным объективом. Капилляр заполняют исследуемой суспензией клеток и при большом увеличении микроскопа находят участок с одной клеткой. Затем под микроскопическим контролем специальным приспособлением этот участок капилляра стерильно выбивают в приемник, из которого затем перенося в стерильную питательную среду.

Основным методом выделения чистой культуры микроорганизмов из отдельной колонии до настоящего времени является метод, предложенный Р.Кохом. Принцип метода базируется на утверждении, что отдельная колония является результатом развития одной клетки и состоит в высеве накопительной культуры на дифференциально-диагностические среды с целью получения из отдельных клеток суспензии изолированных колоний.

При выделении чистых культур аэробных микроорганизмов высев накопительной культуры проводят на поверхность плотной среды. Накопительную культуру или ее разведение наносят на поверхность среды и осторожно распределяют по поверхности стеклянным стерильным шпателем Дригальского. Накопительную культуру на поверхность среды можно наносить и бактериологической петлей в виде «истощающего штриха». После рассева чашки Петри инкубируют в течение 1 – 7 суток, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Чашки просматривают ежедневно и отмечают появление изолированных колоний ( рис.3.4). Выросшие изолированные колонии отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной плотной среды или в жидкую среду.

При выделении чистых культур факультативных аэробов и факультативных анаэробов высев накопительной культуры (или ее разведений) проводят глубинным способом. Для этого 0,5-1,0 см³ клеточной суспензии вносят в стерильную чашку Петри и туда же приливают 10-15 см³ расплавленной и остуженной до 48-50ºС питательной среды. Чашку закрывают и осторожно, круговыми движениями на плоской поверхности, тщательно перемешивают ее содержимое и оставляют до полного застывания среды. После того, как среда застынет, чашки помещают в термостат. При таком способе посева часть колоний оказывается в толще среды. Такие колонии вырезают и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.

При выделении анаэробных микроорганизмов требуется создание условий, ограничивающих доступ кислорода к культуре. Разведения накопительной культуры и посев в чашки Петри с плотной питательной средой проводят так же, как и при глубинном посеве. Чашки с посевами помещают в специальные приборы – анаэростаты, из которых затем откачивают воздух. Остаточное давление не должно превышать 2 – 3 кПа. Анаэробные условия можно создать и в отдельной чашке Петри Для этого высеваемое разведение и питательную среду вносят не в донышко чашки, а в ее крышку. После застывания среды на нее ставят донышко чашки («донышко вошло» в перевернутую крышку) и образовавшийся между ними зазор заливают парафином. Посевы термостатируют и после появления изолированных колоний их извлекают и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемой культуры.

А

Б

Рис. 3.4. Схема выделения «чистой культуры»

поверхностным посевом по методу Коха

А– рост микроорганизмов после рассева шпателем Дригальского;

Б– рост микроорганизмов после рассева бактериологической петлей

Проверка чистоты и идентификация выделенной культуры. Это обязательная стадия в процессе получения чистой культуры. Чистоту культуры, т.е. отсутствие в ней микроорганизмов другого вида, устанавливают визуальным и микроскопическим контролем, а также путем рассева на поверхность плотной питательной среды с последующим анализом выросших колоний. Идентификацию чистой культуры проводят путем установления ее культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков и сравнения их с признаками музейной культуры. Набор сред и их состав определяется особенностями обмена веществ выделяемых микроорганизмов и их возможных спутников.

Чистые культуры хранят в пробирках на плотной питательной среде, периодически пересеивая их на свежие среды. Другими способами хранения чистых культур микроорганиз­мов являются: хранение под слоем вазелинового масла, хранение при низких и ультранизких температурах, хранение в сублимированном состоянии. Основные цели хранения микроорганизмов сводятся к поддержанию их жизнеспособности, сохранению стабильно­сти таксономических признаков, а также определенных свойств, представляющих инте­рес для науки и практики. Задача длительного хранения микроорганизмов состоит в созда­нии условий анабиоза, то есть к торможению процессов обмена веществ в клетке.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганиз­мов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Культуры хранятся в коллекции музея чистых культур и рассылаются научно-исследовательскими отраслевыми институтами на предприятия. В заводской лаборатории культуру проверяют на чистоту и активность и готовят к использованию в производственном процессе, предварительно увеличив ее биомассу во много раз.

Стерилизация