Тема 3. Основы культивирования микроорганизмов

Одна из особенностей микроорганизмов – их необычайная зависимостьот условий окружающей среды. Малые размеры клеток обуславливают тесный контакт микроорганизмов со средой обитания, поэтому они реагируют на изменение условий в большей степени, чем другие живые существа.

Если в окружающей природной среде все необходимые питательные вещества находятся в доступной для микробной клетки форме и показатели физико-химических условий среды соответствуют оптимальным значениям для этого вида микроорганизма, то он активно растет и размножается, увеличивая зону своего распространения. При отклонении параметров среды от оптимальных значений и истощении питательных веществ развитие микроорганизма замедляется или вовсе прекращается. В таком состоянии клетки могут перейти в состояние анабиоза или совсем погибнуть.

Вся практическая микробиология базируется на изучении и практическом применении процессов метаболизма микробных клеток. С этой целью проводят выращивание микробных культур в искусственно созданных условиях. Этот процесс называют культивированием. Оно основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды для жизнедеятельности микроорганиз­мов.

Культивированием называют выращивание микроорганизмов на питательных средах в определенных условиях, а развивающийся при этом организм - культурой. Культивирование при определенной температуре называется инкубированием (инкубацией).

Для проведения культивирования необходимо наличие питательной среды, объекта культивирования и соответствующих физико-химических условий окружающей среды.

Основные элементы культивирования представлены на рис. 3.1.

Рис. 3.1. Основные элементы культивирования микроорганизмов.

Культура, представленная микроорганизмами одного вида, называется чистой. Куль­туру, содержащую более чем один вид микроорганизмов, называют смешанной или гетероген­ной. В природе встречаются только гетерогенные культуры, а в производствах, основанных на использовании биохимической деятельности микроорганизмов, применяют чис­тые культуры.

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств любого микроорганизма проводят его выделение из окружающей среды в чистую культуру. Это дает возможность провести идентификацию микроорганизма, установить его таксономическое положение и определить его практическую ценность. Выделение производят путем изолирования одной клетки микроорганизма одним из приемов. Затем осуществляют ее размножение на подобранной для данного микроорганизма питательной среде, создав элективные (избирательные) условия. Элективные условия обеспечивают преимущественное развитие выделяемой культуры и ограничивают развитие сопутствующих микроорганизмов.

Принципы составления сред для культивирования микроорганизмов.

Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые должны содержать все вещества, необходимые для их роста. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для микроорганизмов являются соединения углерода и азота.

По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы – автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода углекислоту воздуха или карбонаты. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолого-биохимических особенностей организма могут быть представлены различными органическими соединениями, например, углеводами, спиртами, органическими кислотами, углеводородами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и ко второму основному компоненту питательной среды – азоту. Для микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот, используют среды, не содержащие соединений азота. В состав всех других сред входят различные азотсодержащие соединения: нитраты или соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или в белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в других элементах удовлетворяются обычно за счет одних и тех же минеральных солей. Потому так называемый «минеральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу.

Кроме элементов, необходимых для конструктивных процессов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных микроорганизмов соединения углерода в большинстве случаев являются и энергетическим материалом. В средах для хемотрофных организмов эту роль выполняют минеральные соли.

По составу принято выделять естественные, или натуральные, среды неопределенного состава и синтетические среды.

К естественным относятся среды, состоящие их продуктов растительного и животного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, молоко, животные ткани, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов и т.д.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все необходимые для роста и развития компоненты. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются, главным образом, в лабораторной практике для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред относятся мясопептонный бульон (МПБ), неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт и др.

Синтетические - это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Они имеют стабильный химический состав, но не всегда обладают хорошими ростовыми свойствами, поскольку невозможно полностью и в нужном количестве внести все необходимые ростовые вещества в чисто химическом виде. Синтетические среды широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу.

Наряду с синтетическими и натуральными средами выделяют так называемые полусинтетические среды. Главными компонентами таких сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония, фосфаты и т.д., а натуральные природные компоненты содержатся в небольших количествах. Полусинтетические среды также отличаются непостоянством состава, но обладают хорошими ростовыми свойствами и относительно недороги. Они находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

По назначению питательные среды делят на среды общего назначения, селективные и дифференциально-диагностические.

Общего назначения - эти среды пригодны для культивирования большого количества известных микроорганизмов. На таких средах способны развиваться бактерии, актиномицеты, грибы, дрожжи. Естественно, что скорость развития каждого микроорганизма будет зависеть от степени соответствия химического состава такой среды питательным потребностям клетки.

Элективные - предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечивают преимущественное развитие определенной группы микроорганизмов, для которой характерна общность физиологических свойств. Применяют их в процессе идентификации для получения так называемых «накопительных культур».

Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. При их составлении учитываются характерные питательные потребности конкретного микроорганизма. Дифференциально-диагностические среды широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды состоят на 90-98% из воды. Нашли широкое применение в лабораторной практике и в промышленном производстве для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Основу сыпучих сред составляют зерно, жмыхи, разваренное пшено, отруби и другие подобные вещества. Применяют их главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов.

Плотные среды получают из жидких путем добавления к последним уплотняющих компонентов. Для уплотнения сред применяют агар-агар или желатин.

Наиболее часто применяют агар-агар, представляющий собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Агар-агар получают из морских водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 95⁰С и затвердевает при температуре 45⁰С. Обычно агар-агар добавляют в количестве 2-2,5%.

Желатин - это экстракт, получаемый из богатых коллагеном субстратов. Коллаген - белок животного происхождения, содержащийся в костях, хрящах, сухожилиях, чешуе. Образуемый желатином гель плавится при температуре 25⁰С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов. Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмов выделяют в среду. Эти свойства желатина ограничивают его применение в качестве уплотняющего средства. Желатин используют главным образом в диагностических целях - для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. Желатин добавляют к жидким средам в количестве 10-15%.