Окраска простая и сложная (по граму)

Цель занятия. Освоение методов приготовления и окра­шивания бактериальных препаратов.

Задание: Освоить технику приготовления и окрашивания мазка из зубного налета. Посмотреть с иммерсионным объективом окрашенные мазки; определить и зарисовать обнаруженные формы и взаиморасположение микроорганизмов. Ответить на поставленные вопросы .

1.Приготовление бактериальных препаратов

Препарат — мазок для окрашивания, приготовляется в несколько этапов: приготовление препарата; высушивание; фиксация; окраска.

Для приготовления препарата используют предметное стекло - тонкую стеклянную пластинку размером 76x26 мм с хо­рошо отшлифованными краями.

При микроскопировании применяют покровные стекла толщиной 0,15-0,17 мм и размером 18x18, 20x20, 18x24 мм. Их подготавливают заранее обезжиренными.

Чистые стекла берут пинцетом, так как пальцы оставляют на них жирные пятна. Если стекла находятся в жидкой среде, их перед употреблением обсушивают фильтровальной бумагой и слегка обжигают над пламенем горелки. При длительном употреб­лении стекла мутнеют и становятся непригодными для работы.

Препарат-мазок готовится при помощи бактериологиче­ских петель или пастеровских пипеток.

Бактериологическую петлю готовят из платиновой или нихромовой проволоки длиной 5-7 см, толщиной 0,5 мм и при­паивают к ней стеклянную ручку или вставляют ее в металличе­скую — петледержатель. Такая проволока легко стерилизуется на пламени и быстро остывает.

Пастеровские пипетки выполняют из стеклянных трубок диаметром 3-6 мм.

Для приготовления препарата-мазка исследуемую куль­туру микроба осторожно распределяют равномерным тонким слоем на предметном стекле.

Мазок из культур, выросших на плотных средах, гото­вят в определенной последовательности.

На чистое предметное стекло стерильной пипеткой или бактериологической петлей наносят каплю во­ды или физиологического раствора. Пробирку с культурой, из которой необходимо приготовить мазок, в наклонном положе­нии помещают на указательном и среднем пальцах левой руки и сверху прижимают большим пальцем так, чтобы хорошо бы­ла видна вся поверхность питательной среды с выросшими на ней микроорганизмами (рис. а-з).

Прежде чем взять материал из культуры, необходимо прокалить бактериологическую петлю в пламени горелки до покраснения. При этом петля должна находиться в вертикальном положении (а), чтобы пламя охватывало не только всю петлю, но и часть иглодержателя.

При работе петлю или пипетку держат в правой руке, как карандаш при письме. Зажав пробку между мизинцем и ладонью правой руки (в ней же находится подготовленная петля), выни­мают ее из пробирки (б) и держат концом вниз, не допуская сопри­косновения с рукой той части пробки, которая находилась в про­бирке. Открытый конец пробирки обжигают на пламени (в) и от­водят несколько к себе, затем вводят в пробирку петлю (еще раз проведя ее через пламя), охлаждают прикосновением к стенке про­бирки (а) и набирают небольшое количество материала, слегка прикасаясь к культуре и не царапая среды петлей.

После взятия материала (д) пробирку тотчас закрывают той же ватной пробкой (е), а перед этим края пробирки и конец ватной пробки обжигают на пламени горелки. Взятый материал эмульгиру­ют (ж) в имеющейся на предметном стекле капле и равномерно тон­ким слоем петлей распределяют по поверхности (1,5x2 см).

Схема приготовления мазка

Если культура выращена на жидкой питательной среде, то стерильную петлю опускают в жидкость, захватывают каплю и рас­тирают ее на предметном стекле. На обратной стороне стекла обводят восковым карандашом место, где приготовлен мазок. Это об­легчает в дальнейшем нахождение его. После этого петлю прока­ливают (д), с тем, чтобы убить оставшиеся на ней микроорганизмы, и кладут на место.

Для приготовления мазка можно пользоваться и стериль­ной пипеткой. Пастеровскую пипетку предварительно проводят над пламенем горелки, затем пинцетом над прокаленным пламенем горелки обламывают тонкий запаянный конец пипетки и набирают материал. Использованную пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором (5 %-м раствором фенола).

2.Препарат-мазок из зубного налета готовят следующим образом.

На предметное стекло наносят бактериологической петлей каплю физиологического раствора или воды, затем осторожно снимают зубной налет спичкой (без серной головки), растирают в капле и тонким слоем распределяют по поверхности стекла. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают.

Высушивание приготовленного препарата производится на воздухе или в термостате. Подогревать препарат не рекомендуется, так как при быстрой потере влаги происходит грубое свертывание белков, и клетка теряет естественную форму. При высушивании препарат предохраняют от мух, накрывая стеклянным колпаком.

Фиксация высушенного препарата преследует цели: обеспечить лучшее прилипание микробных клеток к стеклу, убить микроорганизмы (мертвые клетки окрашиваются лучше живых).

Фиксация препарата производится над пламенем спиртов­ки или газовой горелки. Предметное стекло берут за уголки боль­шим и указательным пальцами и медленно проводят, держа сто­роной с нанесенным препаратом вверх, через пламя не менее трех раз. В общей сложности мазок должен подвергаться действию пламени не более 2 с. Длительная фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму; недостаточно зафикси­рованный мазок смывается со стекла при последующей обработке. Для фиксации можно использовать различные химиче­ские вещества. В абсолютном спирте мазки выдерживают 15-30 мин, в смеси равных объемов спирта и эфира —2-5 мин., в мети­ловом и амиловом спирте — 5 мин. Фиксируют препарат, погру­жая мазок в кювету с одним из указанных веществ или наливая последние на мазок.

3.Метод простой окраски. При простом методе окраски ис­пользуется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.

Техника окраски. На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы по­крыть всю поверхность мазка.

Фуксином Пфейффера красят 1-2 мин., метиленовым си­ним раствором — 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а ма­зок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.

Сложные методы окраски применяют в целях диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда по­следние не окрашиваются простым способом. К сложным методам относятся, например, окраска по Граму, окраска спор, капсул и др.

4.Окраска по Граму. Универсальный дифференциально-диагностический метод окраски.

По отношению к окраске по Граму все виды микробов принято делить на две группы: грамположительные (грампозитивные) и грамотрицательные (грамнегативные).

Метод окраски по Граму основан на использовании спо­собности магниевых солей рибонуклеиновой кислоты, содержа­щихся в цитоплазме целого ряда микробов (грамположительных), вступать в реакцию с генциан- или кристаллвиолетом и йодом, образовывая стойкое соединение, не разрушающееся при после­дующем воздействии спирта,

Грамотрицательные микробы, имеющие иной состав цито­плазмы, прочного соединения с генцианвиолетом не образуют и при обработке спиртом обесцвечиваются, а при дополнительной окраске водным раствором фуксина окрашиваются в розово-красный цвет.

Техника окраски по Граму

На обычно приготовленный и фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги (несколько уже и короче предмет­ного стекла) и на нее капают карболовый раствор генцианвиолета или кристаллвиолета на 2 мин. Затем бумагу удаляют, краску сли­вают, и на препарат наливают люголевский раствор на 2 мин. (мазок чернеет). Сливают люголевский раствор и в течение 30 с обрабатывают 96-градусным спиртом. Промывают водой. Дополнитель­но 2 мин. окрашивают фуксином Пфейффера. Промывают водой, высушивают и микроскопируют (исследуют под микроскопом).

При этом грамположительные микробы окрашиваются в темно-фиолетовый, почти черный, цвет, а грамотрицательные — в розово-красный.

Шаровидные формы микробов (кокки) в большинстве своем красятся по Граму положительно, извитые формы — отрицательно. Среди палочковидных форм микробов встречаются и грамположительные, и грамотрицательные (палочки, образующие споры, окрашиваются обычно положительно).

5.Рост бактерий. Рост популяции

Когда бактериальные клетки достигают определенных размеров, они переходят к бесполому размножению, которое называется простым делением; при этом клетка делится на две идентичные дочерние клетки. Если одиночную бактерию поместить в питательную среду в оптимальных условиях роста, то она и ее потомки будут делиться каждые 30 мин.

В идеальных условиях рост бактерий является экспоненциальным. При экспоненциальном росте время, которое требуется для удвоения числа бактерий, постоянно. Оно называется временем удвоения, или временем генерации. Идеальную модель роста популяции бактерий можно сравнить с ростом реальной популяции в закрытом сосуде, где нет внешних воздействий, например не добавляются питательные вещества. Графическое отображение численности жизнеспособных бактерий имеет четыре фазы. Первая — это лаг-фаза, в ходе которой бактерии адаптируются к новой среде обитания, и максимальная скорость роста не достигается. В этот период в клетках бактерий могут, например, синтезироваться новые ферменты, необходимые для усвоения тех питательных веществ, которые присутствуют в новой среде.

Следующая фаза роста популяции бактерий - логарифмическая, когда бактерии растут с максимальной скоростью, число бактерий увеличивается почти экспоненциально, т. е. кривая роста представляет собой почти прямую линию. В ходе этой фазы время удвоения остается постоянным и имеет минимальное значение.

Со временем рост колонии начинает замедляться, время удвоения начинает увеличиваться, и культура входит в стационарную фазу, когда скорость роста популяции равна нулю и когда резко возрастает конкуренция за пищевые ресурсы. Образование новых клеток замедляется и затем совсем прекращается. Любое увеличение числа клеток компенсируется одновременной гибелью других клеток, поэтому суммарная численность живых клеток остается постоянной. Переход к этой фазе определяется действием ряда факторов: истощением необходимых питательных веществ, накоплением токсичных продуктов распада, таких как спирт, а в случае аэробных бактерий еще и ограничением доступа кислорода. Рост бактерий замедляется также при изменении рН.

Во время последней фазы - фазы замедления роста - возрастает скорость гибели клеток, и она становится выше, чем скорость размножения. Со временем клетки вообще прекращают воспроизводиться. Те же принципы применимы к росту любых популяций, даже популяций человека. Теоретически любая популяция может достичь экспоненциального роста, если время удвоения остается постоянным. Однако в действительности, рано или поздно в дело вступают лимитирующие факторы и изменяют темпы роста популяции.

Рост бактерий не всегда сопровождается делением. Многие факторы - детергенты, антибиотики, соли жёлчных кислот, УФ-облучение — задерживают деление клеток. В результате образуются длинные нитевидные формы, значительно превышающие по размерам исходные клетки.

6.Оценка роста бактерий.

Прямые методы.

1) Подсчет микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева) или на мембранных фильтрах (этим методом учитывается общее число живых и мертвых клеток).

Подсчет клеток в счетной камере Горяева-Тома. Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий.

Устройство счетной камерой Горяева. Камера представляющей собой толстое предметное стекло с нанесенными на него поперечными прорезями, которые образуют три поперечно расположенные площадки. Средняя из них разделена на две части, на каждой из которых выгравирована сетка (рис. 1, 2) площадью 9 мм², разделенная на 225 больших квадратов площадью 0,04 мм² каждый (15 рядов по 15 квадратов) и 400 малых квадратов площадью 0,0025 мм² каждый (каждый третий ряд больших квадратов в горизонтальном и вертикаль­ном направлении разделен на 16 малых квадратов). Средняя площадка предметного стекла опущена на 0,1 мм относительно двух других площадок, на ко­торые накладывают специальное шлифованное по­кровное стекло размером 18x18 мм, что обеспечивает создание камеры для дрожжевой суспензии.

Рис. 1. Камера Горяева: 1 - предметное стекло; 2 - специальное покровное стекло; 3 - камера для дрожжевой суспен­зии; 4, 6 - площадка для покровного стекла; 5 - сетка для подсчета дрожжевых клеток; 7 - прорезь для введения дрож­жевой суспензии

Количество клеток определяют в соответствии с формулой О = А х К₁ х К₂ х В, где В количество клеток в 1 мл суспензии, шт/мл; А количество клеток в 80 малых квадратах, шт.; К., коэффици­ент глубины камеры (при глубине камеры 0,1 мм К₁ = 10; при глубине камеры 0,2 мм К₁ = 5); К₂ -коэффициент пересчета объема, 1/мл (К₂ = 5000 1/ мл); В - коэффициент разбавления пробы (для дрожжей В =10).

При подсчете дрожжевых клеток в камере Горяева с глубиной 0,1 мм и десятикрат­ным разбавлением дрожжевой суспензии В = 5 х 10⁴ А х В.

В зрелых дрожжах и сбраживаемом сусле (во время главного брожения) количество дрожжевых клеток превышает 80 млн шт/мл.

Рис. 2. Сетка для подсчета дрожжевых клеток в камере Горяева: 1 - большой квадрат; 2 – малый квадрат

При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Эти кольца указывают на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3 - 5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина.

Число клеток подсчитывают с объективом 8х или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Подсчет клеток повторяют 3 - 4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:

А 10³

М = ------------ n,

h S где

М- число клеток в 1 мл суспензии;

А - среднее число клеток в 1 квадрате сетки;

h - высота камеры, мм;

S - площадь 1 квадрата сетки, мм²;

10³ - коэффициент перевода кубических сантиметров в кубические миллиметры;

n - разведение исследуемой суспензии.

2) Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида). Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет можно проводить в удобное для исследователя время. Для этого хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см². Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю 0,03 - 0,1%-ного водного раствора агара.

Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин 96%-ным спиртом и окрашивают 1 - 2 мин фуксином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают, препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4 - 5 стаканов с водой (промывать препарат под струѐй водопроводной воды не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препараты хорошо сохраняются.

3) Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Этот метод применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях.

Фильтрование пробы определенного объема (от нескольких миллилитров до десятков литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.

4) Подсчет колоний на чашках Петри с питательной средой. Здесь определяется толь­ко число жизнеспособных клеток, которые на питательной среде образовали колонии. Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве.

5) Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50 - 100 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле:

AS

М = ---- n,

sV

где М - количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;

А - среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);

s - площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мкм²;

V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;

S - площадь приготовленного мазка, мкм ;

n - разведение исследуемого субстрата.

Косвенными методами считаются:

1) Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца.

2) Учет бактериальной массы взвешиванием или по содержанию общего азота.

- Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 ºС.

- Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен.

3) Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.

4) В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование С0² или кислот).

5) Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1 – 15 сут. инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.

Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 – 50 до 100 – 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле M=a*10n/V,
Где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 10 n – коэффициент разведения.

Вопросы для самоконтроля:

1. Каким образом прикрепляют бактериальные культуры на предметном стекле?

2. С какой целью фиксируют микробиологические препараты?

3. Чем объясняется различие окраски бактерий при окрашивании по Граму?

4. Какие красители дают фиолетовую окраску, а какие розовую?

5.Как называется фаза наиболее интенсивного роста популяций бактерий?

6. Какие причины снижают темпы роста популяций бактерий?

7. Какое свойство бактерий позволяет определять их численность в колониях по общему азоту?

8. Какое число колоний необходимо для определения численности бактерий?

9. Чем определяется методы подсчета численности бактерий?

ВЫВОД: