Методы молекулярно-генетического анализа
Исследования генома микроорганизмов потребовали разработки высокочувствительных и точных методов молекулярно-генетического анализа. Основной целью этих методов является идентификация изучаемых генов, определение последовательности их ДНК (секвенирование), а также изучение их функционирования на молекулярном и клеточном уровнях.
Одним из основных способов генетического анализа является метод молекулярной гибридизации. Он обладает высокой чувствительностью, позволяя выявить до 10-10 г специфической нуклеиновой кислоты в 1 мл материала.
Молекулярная гибридизация основана на взаимодействии комплементарных цепей ДНК или РНК и образовании двунитчатых структур. Она может происходить между комплементарными молекулами ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК.
Ее проводят следующим образом:
Осуществляют деспирализацию генетического материала с образованием одноцепочечных структур;
Проводят адсорбцию материала на твердой фазе (обычно на нитроцеллюлозной мембране);
Обрабатывают материал зондом. Зонд – это специфическая искусственно полученная короткая последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная изучаемой нуклеиновой кислоте и несущая какую-либо метку (обычно радиоактивный фосфор);
Пробы помещают в счетчик радиоактивности и учитывают. Если материал содержал искомую последовательность нуклеиновой кислоты, то это определяется по степени радиоактивности пробы.
Недостатком данного метода является короткий период полураспада изотопа фосфора и необходимость в специальном оборудовании и применении мер защиты. Поэтому наиболее перспективно использование колориметрических реакций, где применяется ферментативная метка.
Одним из наиболее распространенных вариантов молекулярной гибридизации является блотинг по Саузерну (Southern blotting, от англ. blot – пятно, отпечаток). Им выявляют фрагменты ДНК, разделенные электрофорезом в агарозе. Для этого очищенную ДНК нарезают на фрагменты рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Далее проводят электрофорез ДНК. После электрофореза фрагменты переносят с агарозы на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры обрабатывают зондом и затем оценивают положение искомого гена на фильтре.
Если в качестве материала изучается РНК, то применяют аналогичный способ, который получил название Northern blotting – «северный блотинг». Его используют для обнаружения фрагментов РНК.
Гибридизация in situ используется для выявления ДНК и РНК в клетках. Для нее применяют замороженные срезы ткани, полученной при биопсии, а также другие клеточные структуры.
В начале 80-х годов К.Мюллисом был разработан способ, позволивший значительно увеличить чувствительность метода молекулярной гибридизации. Речь идет о так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть способа заключается в следующем: исследуемый материал, содержащий 2-спиральную нуклеиновую кислоту (ДНК), нагревают до 90-1000С, вызывая тем самым расхождение 2-х-цепочечной ДНК на отдельные цепи. В смесь добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК-полимеразу. Праймерами называются синтетические короткие участки ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют. Праймеры обычно располагаются с концов (фланкируют) амплифицируемый участок ДНК и служат затравками (инициаторами) полимеризации.
Реакционную смесь охлаждают (обычно до 70-760С). Праймеры присоединяются к разошедшимся цепям. При этом термостабильная полимераза достраивает 2 разошедшиеся цепи ДНК до полных молекул, удваивая тем самым исходное количество генетического материала. Удвоенное количество генетического материала подвергают повторному расхождению и удвоению и так далее. Проведя несколько десятков циклов полимеризации, можно поднять содержание ДНК в исследуемом материале до порога обнаружения. После этого нуклеиновую кислоту выявляют обычной молекулярной гибридизацией.
ПЦР является самым чувствительным из имеющихся в настоящее время методов, позволяя обнаружить всего 100 молекул ДНК или РНК в 1 мл сыворотки. В случае определения молекул РНК (например – вируса ВИЧ) для проведения полимеразной цепной реакции предварительно получают его ДНК-копию с помощью фермента обратной транскриптазы. Затем ход реакции не отличается от вышеописанного.
Другой важной группой генетических методов исследования являются методы определения первичной последовательности нуклеиновых кислот (секвенирование).
Существует несколько методов секвенирования. Одним из них является способ Максама и Гилберта. Сущность его заключается в следующем: из исходного материала выделяют ДНК и переводят ее в одноцепочечную форму. Четыре исходных набора материала обрабатывают различными химическими соединениями, специфически реагирующими только с определенными нуклеотидами в цепи ДНК: пуриновыми (аденином, гуанином) или пиримидиновыми (тимином и цитозином). При этом цепь ДНК разрезается по соответствующему нуклеотиду, который становится концевым. В результате получается 4 набора различных по длине олигонуклеотидов, причем каждый из них заканчивается на соответствующее основание, которое метят радиоактивным фосфором. Затем материал подвергают электрофорезу в агарозе по четырем параллельным трекам. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку и экспонируют (проводят радиоавтографию). Сопоставляя все 4 трека, определяют последовательность исходного фрагмента ДНК.
Генная инженерия
Результаты, полученные при изучении генома бактерий и вирусов с их способностью к мутационной и рекомбинационной изменчивости, послужили основой для развития одной из наиболее перспективных областей биотехнологии – генной инженерии.
Генная инженерия основана на конструировании клеток с новыми генетическими свойствами. Для этого в геном клетки вводят различными способами ген или группу генов, кодирующих требуемый белок (гормон, цитокин и др.) Тем самым в клетке образуется рекомбинантная (или химерная) молекула ДНК. При получении клона клеток, обладающих нужными признаками, его размножают и выделяют необходимый продукт.
Этот процесс осуществляется несколькими путями.
В качестве клеток-продуцентов используют как прокариотические клетки (например – E.coli), так и клетки эукариотов (дрожжи S.cerevisiae, клетки растений или зародышевые клетки млекопитающих).
Для введения нужного участка ДНК в геном клетки-продуцента используют различные векторы. Вектор представляет собой репликон (плазмиду, бактериофаг, ретровирус), который включает необходимый ген и способен к переносу в клетку-продуцент. В этой клетке вектор путем рекомбинации может встраиваться в ее геном и экспрессировать соответствующий белок. Полученный трансформированный клон клеток способен производить необходимый пептид в течение нескольких поколений.
Последовательность ДНК вектора конструируется особым образом. В ней сохраняются гены, ответственные за проникновение, встраивание в геном и репликацию вектора, и удаляются несущественные для этих процессов гены.
Для этого геном вектора разрезается специфическими эндонуклеазами-рестриктазами. Вместо этих генов в геном встраивают последовательности, кодирующие требуемый белок, и соединяют молекулу ДНК в единую цепь ферментом лигазой.
Очевидно, что встроенная последовательность ДНК не может быть достаточно большой (обычно – до 10-15 тыс пар нуклеотидов), так как более крупные молекулы просто не могут упаковаться в оболочку вектора (например – в головку бактериофага). Для увеличения необходимой последовательности ДНК в настоящее время конструируют смешанные (химерные) векторы, состоящие из фрагментов нескольких векторов.
К ним относят:
а) космидные векторы (космиды). Они включают небольшой плазмидный вектор (4-5 тыс пар нуклеотидов), участки фага лямбда (cos-последовательности), ответственные за упаковку ДНК в бактериофаг, и достаточно протяженный участок требуемой ДНК, например ДНК человека (до 30-45 тыс пар нуклеотидов);
б) фагмиды и фасмиды. Эти два типа векторов схожи, они состоят из фагов и плазмид, однако у фагмид источник репликации вектора – бактериофаг, тогда как у фасмид – плазмида.
В последнее время для генной инженерии эукариотов широко используется метод микроинъекций ДНК в ядро, а также пересадка клеточных ядер из соматических клеток в яйцеклетки.
Сфера практического применения достижений генной инженерии постоянно расширяется, открывая все новые возможности.
Они могут быть использованы для исправления наследственной и ненаследственной патологии обмена веществ (генотерапия); для создания вакцинных штаммов микроорганизмов; для получения трансформированных штаммов бактерий, способных производить биологически активные соединения (антибиотики, гормоны, цитокины, витамины) в промышленных масштабах.
Одной из наиболее важных задач, стоящих перед генной инженерией, является получение библиотек геномов различных видов организмов, включая человека.
Каждый ген, или группа генов, входящих в такие библиотеки, хранится в отдельном клоне клеток или бактериофаге. Так, например, уже созданы фаговые библиотеки генов, кодирующих активные центры (вариабельные участки) иммуноглобулинов человека. Это делает возможным использование генно-инженерных антител в терапии самых разных заболеваний.
Изучение строения геномов, идентификация и определение функции всех генов человека, животных, микроорганизмов открывает перспективы для предупреждения и лечения наиболее тяжелых болезней, таких, как особо опасные инфекции, сахарный диабет, атеросклероз, онкологическая патология. Этими вопросами занимается новейшая область генетики – геномика.