II. Активные формы кислорода.

В основном состоянии молекула кислорода имеет два неспаренных электрона, т.е. представляет собой бирадикал и является значительно менее активным окислителем, чем это следует из его термодинамических свойств.

Основное количество потребляемого человеком молекулярного кислорода участвует в реакции митохондриального окисления, при котором на молекулу О₂ происходит одновременный перенос четырех электронов с образованием двух молекул воды или эквивалентных соединений. Во всех живых организмах постоянно протекают реакции одноэлектронного восстановления, которое приводит к образованию промежуточных продуктов восстановления молекулы кислорода. Эти соединения представляют собой группу различных веществ радикальной и нерадикальной природы, которые обладают высокой реакционной способностью, вследствие чего получили название активных форм кислорода (АФК). К ним относят: супероксидный анион – радикал (О₂^∙-), перекись водорода (Н₂О₂), гидроксильный радикал (HO∙), синглетный кислород (¹О₂), гипогалоиды (HOCl, НОCI, НОBr, НОI, НОSCN), оксид азота (NO^∙) и др.

Рис 1. Основные источники АФК в организме.

Активные формы кислорода представляют собой совокупность короткоживущих, взаимопревращающихся и относительно реакционноспособных форм кислорода, которые возникают в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений.

Рисунок 2. Основные пути и ферменты генерации АФК в организме человека и животных

I – цитохром-с-оксидаза; II – флавиновые оксидазы; III – ксантиноксидаза; IV – NADPH – оксидаза; V – NO-синтаза; VI – реакция Фентона; VII – реакция Хабера-Вайса; VIII – воздействие радиации; IX – перекисное окисление липидов; X–неферментативное окисление гемоглобина; XI – каталаза; XII – миелопероксидаза.

Свободный радикал - это молекула или её часть, имеющая неспаренный электрон на внешней атомной или молекулярной орбите. Свободные радикалы могут быть нейтральными или заряженными – т.н. ион-радикалы.

Свободнорадикальное окисление протекает при участии активных форм кислорода, которые образуются в процессе одноэлектронного восстановления кислорода. Обычно эти реакции своднорадикального окисления протекают в активном центре соответствующих ферментов, а промежуточные продукты не появляются во внешней среде.

Рис.3. Различные виды АФК.

III.Неферментативные пути образования АФК.Химизм процессов СРО.

Различают неферментативное и ферментативное механизмы образования АФК. Заряженные свободные радикалы, называемые катион- или анион-радикалы, образуются в процессе одноэлектронного окисления или восстановления.

При неферментативном механизме образования АФК в основе процесса лежат следующие реакции:

1.	O2 +1 → О2∙-	3.	HO∙ + 1 + 2Н+ → 2Н2О
2.	О2∙- +1 → О2-2+ 2Н+ → Н2О2	4.	HO₂⁻ + H⁺→H₂O₂

Из пероксида водорода в присутствии атомов восстановленного железа Fe²⁺ и (или) О₂^•очень быстро образуется одна из наиболее активных форм кислорода – гидроксильный радикал:

Н₂О₂^Fe2+HO^• + ОН^-- реакция Фентона

Н₂О₂+ О₂^{∙- Fe2+} HO^• + ОН^- + О₂ - реакция Хабера-Вейса

HOCl + О₂^∙- → HO^• +Cl^• + О₂

Одним из основных источников образования АФК является митохондриальная цепь переноса электронов (ЦПЭ). Утечка электронов из ЦПЭ митохондрий и микросом и непосредственное их взаимодействие с кислородом - основной путь образования активных форм кислорода в большинстве клеток.

Рис.4.Реакции образования АФК в дыхательной цепи.

В результате блокирования биохимических процессов (например, при гипоксии) небольшой процент электронов из «главного» потока дыхательной цепи митохондрий восстанавливается в одновалентный молекулярный кислород, который генерирует образование супероксидного анион-радикала кислорода.

Супероксид-анион радикал является высокореакционным соединением, которое вследствие высокой гидрофильности и наличия заряда не может покидать клетку и накапливается в цитоплазме. Его превращения приводят к образованию ряда активных окислителей. Этот радикал может образовываться и под влиянием ультрафиолетовых лучей, а также путем взаимодействия кислорода с ионамиметаллов переменной валентности (чаще всего с железом) или в ходе спонтанного окисления некоторых соединений, например дофамина. Наконец, он может продуцироваться в клетках и такими ферментами, как ксантиноксидаза или NADPH-оксидаза.

Пероксид водорода химически не очень активен, но способствует образованию наиболее токсичной формы кислорода - гидроксильного радикала (ОН^•) по следующей реакции:

Fe²⁺ + Н₂О₂ → Fe³⁺ + ОН^- + ОН^•.

Наличие в клетках Fe²⁺ или ионов других переходных металлов увеличивает скорость образования гидроксильных радикалов и других активных форм кислорода. Например, в эритроцитах окисление иона железа гемоглобина способствует образованию супероксидного аниона:

Hb(Fe²⁺) + O₂ → MetHb(Fe³⁺) + О₂^∙-

IV. Ферментативные пути образования активных форм кислорода

Кроме неферментативного пути образования АФК в организме человека и животных возможно и ферментативное образование супероксидного анион-радикала и перекиси водорода при окислении органических субстратов различными оксидазами. Примерами могут служить супероксиддисмутаза, трансформирующая супероксидные анион-радикалы в перекись водорода и ксантиноксидаза, образующая супероксидный анион-радикал при окислении ксантина в мочевую кислоту.

В клетках ферменты, образующие перекись водорода, локализованы преимущественно в пероксисомах. Кроме ксантиноксидазы в пероксисомах обнаружены уратоксидаза, оксидазы аминокислот, гликолатоксидаза, оксидаза α-гидрооксикислот и ряд других ферментов. Все ферменты пероксисом являются индуцибельными, их активность значительно возрастает при повышении в организме соответствующих субстратов.

Микросомальные монооксигеназы.

Микросомальная система окисления эндогенных органических соединений и ксенобиотиков представляет собой полиферментный комплекс цепей переноса электронов, зависимый от NADPH и NADH. Общим звеном системы является цитохром Р-450. В состав этого комплекса входят цитохром b5, NADPH-цитохром Р-450-редуктаза, NADH -цитохром b5-редуктаза:

Наиболее важной реакцией микросомального окисления является гид-роксилирование, сущность которого заключается во внедрении одного атома активированного кислорода в окисляемое вещество, в то время как другой его атом идет на образование воды. Превращение атомов кислорода в молекулу воды и гидроксильную группу осуществляет цитохром Р-450.

Наряду с монооксигеназной активностью, Р₄₅₀ может проявлять и оксидазную активность, генерируя супероксидный анион-радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал.

Ксантиноксидоредуктаза.

Ксантиноксидаза (КО) - Mo-, Fe- и Cu- содержащий флавопротеин, катализирующий у человека конечную стадию окисления пуринов, а также окислительную трансформацию птеридинов и некоторых алифатических и ароматических альдегидов.

В нормальных условиях КО находится в дегидрогеназной форме и катализирует окисление ксантина с участием NAD⁺ в качестве акцептора электронов с образованием мочевой кислоты.

Однако при некоторых патологических состояниях, в частности при ишемии органов, в результате активирования внутриклеточных Ca²⁺-зависимых протеаз ксантиндегидрогеназа подвергается протеолизу с отщеплением короткого пептида и необратимо превращается оксидазную форму. Акцептором электронов в оксидазной реакции выступает кислород.

Рис.5.Образование мочевой кислоты и супероксидного анион-радикала при окислении пуринов в ксантиноксидоредуктазной реакции.

КО содержит I молибденовый центр, два железосерных центра и I FAD. На молибденовом центре происходит восстановительная полуреакция каталитического цикла, когда ксантин превращается в мочевую кислоту, на FAD-центре молекулярный кислород превращается в пероксид водорода или супероксид-ион в зависимости от уровня восстановленности фермента.

Наибольшая активность КО у человека определяется в тканях печени и слизистой тонкого кишечника.

NADPH-оксидаза.

Наряду с ксантиноксидазой мощным продуцентом супероксидного анион-радикала является NADPH -оксидаза фагоцитирующих клеток.

NADPH-оксидаза катализирует восстановление молекулярного кислорода до супероксидного радикала, который затем превращается в перекись водорода и другие токсичные формы кислорода (гидропероксидный и гидроксидный радикалы). Перекись водорода, хлор и миелопероксидаза нейтрофила образуют систему, вырабатывающую чрезвычайно токсичные вещества: гипохлорит и молекулярный хлор. NADPH-оксидаза - это мультикомпонентная система, представляющая собой часть дыхательной цепи митохондрий и состоящая в исходном неактивном состоянии из флавопротеида и цитохрома. Компонентами NADPH-оксидазы являются четыре белка, которые образуют фермент после того, как собираются вместе в клеточной мембране. Два из них - относятся к мембранным белкам и образуют гетеродимер цитохром b558. Два других белка - цитоплазматические. Они соединяются с цитохромом b558 после активации фагоцита. В результате возникает NADPH-оксидаза, необходимая для образования супероксидного анион-радикала.

Генерация супероксидного анион-радикала при активации фагоцитов играет важную роль в реализации их микробицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия. В результате дисмутации супероксидный анион-радикал образует перекись водорода, которая используется миелопероксидазой фагоцитов для производства гипохлорит-ионов, обладающих высокой реакционной способностью; перекись водорода при взаимодействии с ионами двухвалентого железа дает гидроксильный радикал, а при реакции с оксидом азота образуется пероксинитрит. Таким образом, супероксидный анион-радикал, генерируемый активными фагоцитами, служит основой для образования других активных свободных радикалов, обеспецивающих микробицидное действие.

5. Активные формы хлора и азота. Ферментативные реакции их образования

NО-синтаза.

Ферментативным путем образуется и азотсодержащий радикал кислорода - оксид азота (NO∙). Синтез оксида азота в организме человека и животных происходит при ферментативном окислении L-аргинина. Процесс является довольно сложным и катализируется специфическими ферментами NO-синтазами (NOS), кофакторами выступают NADPH, тетрагидробиоптерин, флавинадениндинуклетотид и флавинмононуклеотид.

Оксид азота обладает широким спектром биологического действия:

1. Играет ключевую роль в регуляции сосудистого тонуса.

2. Расслабляет гладкую мускулатуру.

3. Предотвращает агрегацию тромбоцитов и адгезию нейтрофилов к эндотелию.

4. Является важным нейромедиатором.

5. Обладает цитотоксической и микробицидной активностью.

В практическом здравоохранении широко используются нитратсодержащие противоангинальные препараты (нитроглицерин, нитросорбид, амилнитрит и др.), лечебный эффект которых обосновано связывают с их способностью высвобождать в организме оксид азота.

Миелопероксидаза.

При взаимодействии перекиси водорода с ионами хлора образуется высокоактиный гипохлорит-ион. Реакция катализируется миелопероксидазой (МПО), которая локализуется в азурофильных гранулах нейтрофильных гранулоцитов. МПО (Н₂О₂-оксидоредуктаза) представляет собой гемопротеин, состоящий из двух тяжелых (β) и двух легких (α) субъединиц; β-субъединицы соединены одной дисульфидной связью и содержат 2 ковалентно связанные железосодержащие простетические группы.

Первичным продуктом, образующимся при окислении хлоридов миелоперксидазой, является хлорноватистая (гипохлорная) кислота (HOCl), которая находится в равновесии с гипохлорит-ионом (OCl^-):

Н₂О₂ + Cl^−МПОHOCl +OH^-

HOCl → H⁺ +OCl^-

Стимуляция фагоцитоза, сопровождающаяся дегрануляцией нейтрофилов, приводит к высвобождению МПО и образованию гипохлорит иона, являющего важным микробицидным фактором полиморфноядерных лейкоцитов. Гипохлорит-ион является сильным окислителем, он накапливается и хранится в нейтрофилах в специальных гранулах, мембрана которых предохраняет клеточные структуры от повреждающего воздействия гипохлорит-иона.

Гипогалоиды представляют собой мощные токсины, чрезвычайно реакционоспособные в химическом отношении и взаимодействуют с органическими молекулами, либо галогенируя их, либо окисляя. При взаимодействии с гипогалоидами в первую очередь окисляются сульфгидрильные и тиоэфирные группы белков, поэтому наличие в среде белковых молекул, содержащих подобные группы, существенно снижает цитотоксическое действие гипогалоидов. Так, основным сывороточным ингибитором гипогалоидов считается альбумин.

Гипогалоиды способны окислять железосерные центры и гемовые группы ферментов. Гипогалоиды могут как индуцировать, так и ингибировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ). Индукция ПОЛ может быть вызвана освобождением железа в каталитически активной форме (Fe²⁺), одновременно гипохлорит может взаимодействовать с Fe²⁺ с образованием гидроксильного радикала:

Fe²⁺ + OCl^- + H⁺→ Fe³⁺+ OH∙+ Cl^-

Установлено, что гипохлорит-ион легко проникает в поверхностный фосфолипидный слой циркулирующих в крови липопротеидов низкой плотности и, вызывая их окисление, индуцирует тем самым эффективный захват окисленных липопротеинов макрофагами через «скэвэнджер»-рецепторы.

V.Механизмы повреждающего действия окислительного стресса: повреждение белков, нуклеиновых кислот, деградация мембранных фосфолипидов, образование межмолекулярных комплексов.

Активные формы кислорода химически очень агрессивны: они повреждают белки и ДНК и, главное, вызывают перекисное окисление липидов - самоподдерживающийся процесс, ведущий к тяжелому повреждению мембран

Повреждение ДНК

Молекула ДНК может повреждаться напрямую, в основном - гидроксид-радикалом и (в гораздо меньшей степени) супероксид-анионом кислорода. Гидроксид-радикал HO∙ может действовать на пуриновые и пиримидиновые основания, а также на остатки рибозы и дезоксирибозы.

Супероксид-анион обладает избирательным действием, взаимодействуя с гуаниновыми основаниями, в результате чего образуются их разнообразные окисленные производные, в том числе и конечный продукт окисления гуаниновых оснований, 7,8-дигидро-8-гидроксигуанозин. Радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов, также повреждают молекулы ДНК. В ряде экспериментов было показано, что митохондриальная ДНК (мтДНК) подвергается окислительному действию АФК даже в большей степени, чем ядерная, так как она находится в непосредственной близости от источников АФК и не защищена гистонами. При взаимодействии перекиси водорода, образующейся в дыхательной цепи с ионами Fe²⁺ и Сu²⁺, которые присутствуют в митохондриальных мембранах, образуется гидроксид-радикал, который и повреждает мтДНК. Она может повреждаться также и при действии перекиси водорода, образующейся в моноаминооксидазной реакции. Повреждение мтДНК приводит к неправильному синтезу компонентов дыхательной цепи, вследствие чего нарушается дыхательная цепь митохондрий и усиливается утечка супероксид-аниона. Повреждение ДНК происходит и в результате действия эндонуклеаз, которые активируются при повышении концентрации внутриклеточного Ca²⁺, наблюдаемом в ходе окислительного стресса.

В результате действия АФК на молекулу ДНК возникают хромосомные аберрации, которые представляют собой нарушения структуры хромосомы.

Повреждение белков

Наиболее распространенный и легко обнаруживаемый тип повреждения белков - образование карбонильных групп при окислении аминокислот: лизина, аргинина и пролина. В условиях окислительного стресса происходит окислительная модификация белков. Свободные радикалы атакуют белки по всей длине полипептидной цепи, нарушая не только первичную, но и вторичную, и третичную структуру белков, что приводит к агрегации или фрагментации белковой молекулы. Многие ферменты, содержащие SH-группы, такие как АТФазы или дегидрогеназы, легко окисляются в результате свободнорадикальной атаки.

В процессе окислительной модификации белка образуются различные стабильные метаболиты аминокислот.

Обсуждение возможной окислительной деструкции белков в организме до последнего времени носило, в основном, теоретический характер. В ряде исследований этот процесс рассматривается как одна из возможных причин инактивации ферментов, изменения структурной организации белков при состоянии окислительного стресса. Примером окислительной модификации белков является фермент - ксантиндегидрогеназа, которая превращает ксантин (и гипоксантин) в мочевую кислоту, а мочевая кислота, в свою очередь, выступает как неферментативный компонент антиоксидантной системы. В результате действия АФК происходит окисление SH-групп этого белка и превращение ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Последняя, одновременно с мочевой кислотой, начинает образовывать супероксид-анион кислорода, что вызывает дополнительное увеличение концентрации свободных радикалов в тканях.

Если белок содержит металл с переменной валентностью, в присутствии перекиси водорода образуется гидроксид-радикал, окисляющий аминокислоты в активном центре фермента, что может привести к его инактивации. Так, в организме мышей, мутантых по гену Mn-СОД, где супероксид-анион не утилизируется в достаточной степени, повреждение комплекса I митохондрий, сукцинатдегидрогеназы и ферментов, содержащих железосерные кластеры, приводит к нарушению функции цикла трикарбоновых кислот и работы митохондриальной дыхательной цепи.

Карбоксильные группы белков под действием АФК превращаются в карбонильные группы, которые, в свою очередь, могут взаимодействовать с аминогруппами, образуя Шиффовы основания, приводящие в конечном итоге к образованию поперечных сшивок между белковыми молекулами и нарушению их активности. Процесс химического сшивания наблюдается и при гликировании белков, который существенно активируется при окислительном стрессе.