Кинетические закономерности односубстратных ферментативных реакций. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен

Уже в первых работах исследователей ферментативных реакций было обнаружено, что начальная скорость ферментативной реакции при фиксированной концентрации фермента и малых концентрациях субстрата линейно зависит от концентрации субстрата, и что для высоких концентраций субстрата такой зависимости уже не наблюдается.

Л. Анри (1903) первым предположил, что фермент образует промежуточное соединение с субстратом. Если обозначить фермент E, субстрат S, то это соединение (интермедиат) обозначится ES.

Л. Михаэлис предложил для количественного описания кинетики этой реакции механизм, состоящий из двух стадий (первая ­- обратимая и быстрая, вторая - необратимая и медленная):

.

Система кинетических уравнений для реакции имеет довольно сложный вид:

;

;

;

; ; .

Точное аналитическое решение такой системы представляет большие сложности, поэтому на практике очень часто используют приближения квазиравновесных и стационарных концентраций.

Для данного механизма скорость реакции определяется скоростью образования конечного продукта

. В свою очередь, скорость образования промежуточного соединения ES,согласно закону действующих масс, можно записать:

. Уравнения материального баланса для фермента и субстрата имеют вид

и

,

где и – начальные концентрации фермента и субстрата; и – их текущие концентрации; и - текущие концентрации промежуточного соединения и продукта.

Решение системы из трех уравнений находится при выполнении следующих условий:

1) на практике основные параметры ферментативной реакции определяют, изучая зависимость начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата, поэтому можно считать, что при τ → 0 → 0,т.е. ;

2) обычно >> , поэтому с учетом условия (1) ;

3) для ферментативных реакций характерно следующее соотношение констант скоростей стадий , т.е. промежуточное вещество ( ES ) является неустойчивым и его концентрация мала. В этом случае используют приближение квазистационарных концентраций, суть которого выражена соотношением

.

Преобразовывая уравнения, получаем выражение

,

которое после деления числителя и знаменателя на принимает вид

.

Величину принято по решению ИЮПАК называть константой Михаэлиса.

Преобразовывая уравнения, получаем выражение для скорости образования продукта в начальные моменты времени

.

Анализ уравнения позволяет объяснить наблюдаемые на опыте закономерности.

Если << K_M , тогда

,

т.е. начальная скорость линейно зависит от концентрации субстрата, что подтверждает наблюдаемый на опыте первый порядок реакции по субстрату.

Если >> K_M, то

,

т.е. начальная скорость реакции не зависит (как и в опыте при больших значениях концентраций субстрата) от концентрации субстрата, порядок реакции по субстрату будет нулевой, по ферменту – первый, а сама скорость достигает предельного значения :

.

При достижении значения (кроме предельной, ее называют еще максимальной скоростью) концентрация фермент-субстратного комплекса , то . Это означает, что весь фермент переходит в состав промежуточного соединения, т.е. фермент насыщается субстратом. Именно в этих условиях удобно сравнивать скорости различных реакций, поэтому

,

где K_M и – параметры уравнения Михаэлиса − Ментен.

Следует отметить, что уравнение вида (18) характерно для кинетики гомогенных, ферментативных и гетерогенных каталитических реакций.

Физический смысл константы Михаэлиса можно пояснить: она численно равна концентрации субстрата (K_M = ), при которой активность фермента составляет половину максимальной, иначе говоря, = 0,5 . Это наглядно видно из графика в координатах ( _, ), представленного на рис.1.

Константа Михаэлиса K_M и начальная концентрация субстрата имеют одинаковую размерность концентраций: М (моль·л^-1). Численные значения K_M обычно лежат в пределах 10 ^-2 -10 ^-8 М, легко воспроизводятся и не зависят от концентрации фермента. В то же время K_M является функцией температуры, рН среды, зависит от присутствия других веществ, играющих роль ингибитора или активатора.

Зависимость начальной скорости ферментативной реакции

от начальной концентрации субстрата

Если для рассматриваемого механизма реакции выполняется условие >> , то в этом случае можно говорить, что на стадии

устанавливается равновесие. Это позволяет использовать при анализе ферментативных реакций приближение квазиравновесных концентраций. В этом случае выражение для константы Михаэлиса упрощается и становится прозрачным ее физико-химический смысл:

,

где K_S - так называемая субстратная константа, т.е. константа диссоциации фермент-субстратного комплекса на фермент и субстрат, характеризующая меру связывания фермента с субстратом. В этом случае можно рассматривать K_M как величину, характеризующую сродство фермента к субстрату.

. В общем случае K_M ≥ K_S , причем экспериментальное значение K_M представляет собой максимальное значение K_S.

Иная картина наблюдается только для ферментов разложения пероксида водорода, каталазы и пероксидазы, для которых >> . В этих случаях константа Михаэлиса K_M ≈ k₂ /k₁ сильно отличается от субстратной константы K_S (не работает приближение квазиравновесных концентраций).

Величина , определяемая из экспериментальных данных , для ферментов с неизвестной молекулярной массой является просто кинетическим параметром , однако для ферментов с известной молекулярной массой, т.е. таких, для которых можно рассчитать начальную концентрацию , эта величина становится фундаментальным параметром, так как позволяет определить из значение константы

,

характеризующей скорость распада фермент-субстратного комплекса на продукт и фермент.

Величину называют также числом оборотов фермента, так как она указывает на число моль субстрата, превращенных в продукт одним молем фермента в единицу времени.