После окончания работы необходимо привести рабочее место в порядок, сдать его дежурному и вымыть руки; в случае необходимости обработать руки дезраствором.

Педиатрия

ЗАНЯТИЕ 1

ТЕМА: Микроскопический метод исследования. Морфология бактерий. Простые и сложные методы окраски. Метод Грама.

Цель:

1. Приобрести навыки соблюдения правил противоэпидемического режима и техники безопасности в бактериологической лаборатории.

2. Овладеть микроскопическим методом исследования.

Знать:

1. Правила работы в микробиологической лаборатории.

2. Суть микроскопического метода исследования и его назначение.

3. Морфологию и структуру микроорганизмов.

4. Простые и сложные методы окраски микроорганизмов.

5. Метод Грама и его назначение.

Уметь:

1. Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах.

2. Окрашивать препараты простыми методами и по методу Грама.

3. Микроскопировать, дифференцировать микроорганизмы по морфо-тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.

Контрольные вопросы:

1. Классификация царства прокариот.

2. Морфология бактерий: форма, величина, взаимное расположение.

3. Простые и сложные методы окраски; их информативность.

4. Метод Грама: методика, механизм и его назначение.

5. Типы микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный и др.) и специальные методы микроскопии (темнопольная, фазовоконтрастная).

6. Устройство биологического микроскопа. Разрешающая способность микроскопа.

7. Правила работы с иммерсионной системой.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Приготовить фиксированные препараты из культур №1 и №2, окрасить соответственно метиленовой синькой Леффлера и водным фуксином Пфейффера (1:10).

2. Приготовить фиксированный препарат из смеси культур № 3 и №4, окрасить по методу Грама.

3. Промикроскопировать полученные препараты и провести идентификацию микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.

4. Промикроскопировать демонстрационные препараты (окраска по методу Грама) из культур стрептококков, бацилл сибирской язвы; провести идентификацию микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах.

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.

· Приготовьте предметное стекло, спиртовку, пробирку с физиологическим раствором, бактериологическую петлю и пробирки с исследуемыми культурами, растущими на плотных и (или) жидких питательных средах. Зажгите спиртовку, предварительно ее проветрив, приподняв фитиль и канюлю. Спиртовка должна находиться прямо перед Вами, на удобном для работы расстоянии. Для стерилизации бактериальную петлю прокалите в пламени спиртовки, остудите сначала в воздухе в течение 2-3 с., затем о внутреннюю поверхность пробирки (ниже верхней трети длины). Заберите бактериальной петлей физиологический раствор (0,9% р-р NaCl) и нанесите каплю на чистое обезжиренное предметное стекло. Стекло должно находится в чашке Петри; категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе ! Вновь прокаленной и остуженной петлей возьмите немного биомассы, прикоснувшись к ней петлей. Культуру суспензируют в капле физиологического раствора до появления легкой мути, после чего остатки биомассы на петле необходимо высушить и сжечь в пламени спиртовки. Микробную взвесь на стекле распределите остуженной петлей тонким равномерным слоем на площади диаметром 1-1,5 см. После приготовления мазка петлю сразу обязательно прокалите и поставьте в штатив.

Мазок из жидкой культуры №2 готовят также, но без использования физиологического раствора. Препарат из культур №3 и №4 готовится в том же порядке с последовательным внесением исследуемых культур.

· Полученный препарат высушите на воздухе в чашке Петри. Запрещается покидать рабочее место и оставлять мазок без присмотра !

· Высушенный препарат зафиксируйте путем 3-х кратного проведения через пламя спиртовки мазком вверх так, чтобы общее время пребывания его в пламени было около 6 с. Контролем правильности фиксации препарата служит прикосновение стекла к тыльной стороне ладони; стекло должно быть горячим, а не теплым. В противном случае фиксацию необходимо повторить. После того, как стекло остынет, границы мазка обведите стеклографом с нижней стороны. Цели фиксации: инактивация микроорганизмов; прикрепление микроорганизмов к стеклу; улучшение проникновения красителя внутрь микробной клетки.

· Фиксированный препарат из культуры №1 окрашивается метиленовой синькой Леффлера: для этого нанесите краску на мазок и через 3-5 мин смойте водой. Препарат высушите фильтровальной бумагой.

Препарат из культуры №2 окрасьте водным фуксином Пфейффера (1:10) в течение 1-2 мин.

Метод окраски, при котором применяется лишь один краситель, называется простым.

Препарат из смеси культур №3 и №4 окрасьте по методу Грама: поместите на препарат бумажку, пропитанную раствором генцианвиолета (модификация Синева), смочите ее водой, через 1-2 мин бумажку снимите, а краску слейте; налейте раствор Люголя на 1 мин, слейте; обесцветьте 96°спиртом в течении 10-30 сек. до прекращения отхождения струек краски; промойте водой; докрасьте водным фуксином (1:10) в течение 1-2 мин, промойте водой; высушите фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные – в розово-красный цвет, что связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.

Для получения достоверного результата при окраске по методу Грама необходимо точно соблюдать правила приготовления мазков, продолжительность окраски и обесцвечивания спиртом. Толстые, густые мазки будут окрашиваться неравномерно и заведомо грам (-) бактерии могут окраситься грамположительно. При окраске тонких мазков основная ошибка заключается в «переобесцвечивании» мазка спиртом и поэтому грам (+) бактерии окрашиваются грамотрицательно. Имеет значение и возраст культуры. В старых культурах грам (+) бактерии могут окраситься грамотрицательно.

Метод окраски, при котором применяется два и более реактива, называется сложным. В микробиологической практике этот метод имеет дифференциально-диагностическое значение.

II. Освоение техники микроскопии с иммерсионной системой.

Микроскопию окрашенных препаратов в микробиологической практике производят с иммерсионным объективом, который обладает более высокой разрешающей способностью, чем сухой. При этом обязательным условием является погружение объектива в масло, показатель которого совпадает с показателем преломления стекла (1,52). Для этих целей применяют так называемое иммерсионное масло – кедровое или терпеновое масло. В этом случае пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рассеивается и лучи, не меняя своего направления, попадают в объектив. Иммерсионный объектив дает увеличение х90, а в сочетании с окуляром х10 получается увеличение в 900 раз.

Порядок работы с иммерсионным микроскопом:

1. Поднять конденсор вверх до уровня предметного столика, поставить зеркало плоской стороной.

2. Поставить объектив х8 и, глядя в окуляр, движением зеркала добиться наилучшего освещения поля зрения.

3. На предметное стекло с микропрепаратом нанести каплю иммерсионного масла, положить его на предметный столик и установить объектив х90. Под контролем глаза, глядя сбоку, осторожно опустить, пользуясь макровинтом, тубус до погружения объектива в иммерсионное масло. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может привести к повреждению фронтальной линзы. Затем, наблюдая в окуляр, при осторожных поворотах макровинта находят контуры микробных клеток и фокусируют изображение микровинтом, вращая его в пределах только одного оборота !.

По окончании микроскопии поднимите тубус, снимите препарат и поместите его в дезинфицирующий раствор; осторожно сотрите масло с иммерсионного объектива, опустите конденсор и переведите револьвер на объектив х8.

Изучите приготовленный препарат под микроскопом. Обратите внимание на форму микроорганизмов (кокки, палочки, извитые), на их размеры, взаимное расположение и окраску. При увеличении микроскопа около 900, бактерии, имеющие размер 1 мкм, будут выглядеть равными, примерно 1 мм. Таким образом, можно приблизительно определить размеры бактериальной клетки. Зарисуйте увиденные в поле зрения микроорганизмы в протоколе, соблюдая пропорции клеток. Опишите их, сделайте вывод.

После окончания работы необходимо привести рабочее место в порядок, сдать его дежурному и вымыть руки; в случае необходимости обработать руки дезраствором.

III. Промикроскопировать демонстрационные препараты стрептококков, бацилл сибирской язвы, окрашенные по методу Грама и полученные результаты занести в протокол.

Ожидаемые результаты: Streptococcus spp. Препарат из бульонной культуры. Грам (+) полиморфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, расположенные, в основном, цепочками.

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, препарат из бульонной культуры. Грам (+) крупные палочки (5-10 х 1-2 мкм) с обрубленными концами, расположенные длинными цепочками в виде «бамбуковой трости».

ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

Протокол-отчет№ ____от________Ф. И. О.____________№ группы________

ТЕМА:

Цель

Метод и его содержание

Полученные результаты

Выводы

Вопросы для самоконтроля:

1. Назовите отличительные признаки микроорганизмов, как представителей царства прокариот.

2. Какие свойства микроорганизмов лежат в основе микроскопического метода исследования?

3. Назовите и обоснуйте какие методы окраски микроорганизмов (простые или сложные) являются более информативными.

4. Обоснуйте дифференциально-диагностическое значение метода Грама в микробиологической практике.

5. Обоснуйте необходимость использования иммерсионной системы для изучения микроорганизмов.

Литература:

Учебник:

1. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С.28-30, 43-44, 50-52, 255-260.

Лекции по микробиологии.

Тесты.