Методические указания к практической работе. Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Продолжительность занятия: 3 академических часа (135 минут)

Место проведения занятия: учебная аудитория

Материально-техническое оснащение – таблицы, стенды, микроскопы, микропрепараты, вакцины

Хронометраж практического занятия:

1. Вводное слово преподавателя – 5 мин

2. Проверка исходного уровня знаний (тест-контроль) – 15 мин

3. Разбор теоретических вопросов по теме «Стафилококки» – 80 мин

a. Морфологические и культуральные свойства стафилококков

b. Токсины и ферменты патогенности

c. Эпидемиология стафилококковых инфекций

d. Современная классификация стафилококков

e. Микробиологический диагноз стафилококковых инфекций

f. Специфическая профилактика и терапия стафилококковых инфекций

4. Выполнение практической работы – 35 мин

Практическая работа

1. Изучение мазков из чистой культуры стафилококка, окрашенных по Граму (зарисовать)

В препарате из чистой культуры видны грамположительные кокки, располагающиеся скоплениями в виде “виноградных гроздьев”. Могут встречаться единичные кокки или маленькие кучки.

2. Изучение мазков из гноя, окрашенных по Граму (зарисовать)

В мазке, на фоне клеточного детрита, окрашенного в розовый цвет, видны лейкоциты и грамположительные кокки, расположенные одиночно или небольшими кучками, не образующие капсул. Расположение кокков позволяет предположить длительность заболевания. Если заболевание свежее, то микробы располагаются внеклеточно, в более поздние сроки болезни можно наблюдать кокки, фагоцитированные лейкоцитами.

3. Изучение характера роста стафилококков на кровяном агаре (зарисовать)

Посев на кровяном агаре позволяет определить тип гемолизина, выделяемого стафилококками. Гемолитическая активность является одним из признаков патогенности стафилококков. Для приготовления кровяного агара, к 1,8 % МПА расплавленного и остуженного до 45–50 градусов добавляют 5% дефибринированной или свежевзятой крови животного (кролика, барана, крупного рогатого скота) или человека. После тщательного перемешивания агар разливают по чашкам. Гемолизин стафилококков вызывает растворение стромы эритроцитов, поэтому вокруг колоний стафилококков, обладающих гемолитической активностью, образуются светлые зоны гемолиза. Штаммы, образующие альфа-гемолизин, вызывают гемолиз кроличьих и бараньих эритроцитов, бета-гемолизин вызывает тепло-холодовой гемолиз только бараньих эритроцитов. Вокруг колоний стафилококков без гемолитической активности кровяной агар не изменен.

4. Изучение характера роста стафилококков на желточно-солевом агаре (ЖСА) (зарисовать)

Посев на желточно-солевом агаре проводят для определения лецитовителлазы (лецитиназы). Для приготовления ЖСА к 10% солевому агару, расплавленному и остуженному до 60 градусов, добавляют 10% желточной взвеси (1 желток асептично взбалтывают в 200 мл физиологического раствора), агар тщательно смешивают и разливают в чашки.

St.aureus образует на желточно-солевом агаре непрозрачные круглые, слегка выпуклые колонии золотистого или желтого цвета. Среда вокруг колоний мутнеет за счет расщепления липовителлина (комплекс жира и белка), содержащегося в желтке ферментом лецитиназой. В результате действия фермента от липовителлина отрываются жирные кислоты, степень дисперсности белка уменьшается, происходит преципитация его, что приводит к помутнению среды. Освобождение жирных кислот сопровождается образованием “радужного” ореола вокруг колоний (лецитиназоположительные стафилококки).

St.epidermidis на желточно-солевом агаре образует колонии белого цвета или лимонно-желтые с ровным краем, среднего размера. Среда вокруг колоний не изменена (лецитиназоотрицательные стафилококки).

5. Изучение характера роста стафилококков на молочно-солевом агаре (зарисовать)

Молочно-солевой агар используют для выделения стафилококков из материала, обильно обсемененного микробами, а также для определения пигмента образуемого стафилококками. Для приготовления молочно-солевого агара к 6,5% солевому агару, расплавленному и остуженному до 50 градусов, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока. Агар тщательно перемешивают с молоком и разливают в чашки. Для лучшего выявления пигмента посевы инкубируют 18-20 часов при 37 градусах, а затем до 2 суток при комнатной температуре в рассеянном свете.

St.aureus образует колонии золотистого цвета средних размеров, блестящие, выпуклые. St.epidermidis образует подобные колонии белого цвета. St. citreus (только как образующий пигмент) образует подобные колонии лимонно-желтого цвета.

6. Изучение лабораторной диагностики стафилококковых инфекций по схеме (зарисовать)

Основные методы микробиологического исследования:

- микроскопический

- бактериологический

Микроскопический метод. Метод основан на обнаружении стафилококков при микроскопическом исследовании мазков из материала, которые окрашивают по Граму. Под микроскопом изучают гной, отделяемое ран, слизь и налеты с миндалин и другой материал, содержащий большое количество микробов. Микроскопическое исследование крови не производят, так как кокки в мазках обнаружить не удается. Жидкий материал наносят на предметное стекло пипеткой или петлей. Густой материал растирают на стекле в капле воды, материал с тампона размазывают по стерильному предметному стеклу. В мазках обнаруживают грамположительные кокки среди лейкоцитов или внутри них. Отмечают степень обсемененности. Определить вид кокков в мазке не всегда удается, поэтому микроскопическое исследование носит ориентировочный характер. Но даже обнаружение в материале типичных по морфологии стафилококков не позволяет поставить диагноз инфекции, потому что присутствие стафилококков в исследуемом материале не всегда является доказательством его этиологической роли, по морфологии невозможно отдифференцировать патогенные стафилококки от непатогенных. Поэтому наряду с микроскопическим исследованием обязательно проводят бактериологическое исследование.

Бактериологический метод. Бактериологический диагноз основан на выделении чистой культуры стафилококка путем посева и определения его патогенных свойств. Этот метод используется также для установления источника инфекции факторов передачи инфекции, определения схемы антибактериальной терапии, ее эффективности, контроля за лечением и эпидемическим режимом в лечебных учреждениях. Важным условием бактериологической диагностики является определение качественных и количественных критериев содержания патогенного стафилококка.

Исследование гноя (слизи из носа или зева, налета)

Для посева материала выбирают необходимые питательные среды. Стафилококки к питательным средам неприхотливы и способны расти на МПА. Но для повышения высеваемости и возможности провести количественный учет и надежно отличить патогенные стафилококки от непатогенных используют элективные питательные среды. В качестве элективных сред используют молочно-солевой, желточно-солевой агар или молочно-желточно-солевой агар. Элективность этих сред обеспечивается высоким содержанием хлорида натрия (6,5–10%), добавленное молоко позволяет определить цвет образуемого пигмента, а яичный желток – выявить лецитовителлазную (лецитиназную) активность, которая является одним из факторов патогенности стафилококков.

Для посева материала используют также кровяной агар, который дает возможность определить наличие пигмента и гемолитическую активность. Однако нужно помнить, что результат исследования (наличие гемолитической активности) зависит от вида крови, ее концентрации, густоты крови, присутствия и характера сопутствующей флоры. Поэтому использование кровяного агара рекомендуется для первичного посева материала, не содержащего другой микрофлоры.

Для оценки обсемененности производят количественный посев материала, готовя из него разведения, и высевают по 0,1 мл из разведений десять во второй, десять в четвертой и десять в шестой степенях. С тампона засевают цельный материал. Посевы на ЖСА инкубируют в течение 2 суток, а на кровяном агаре – 18–20 часов.

Так как ЖСА является элективной средой, то на нем вырастают только колонии стафилококков. Обращают внимание на наличие лецитиназоположительных колоний, подсчитывают их, отбирают 2-3 колонии для дальнейшего исследования. Если на ЖСА вырастают только лецитиназоотрицательные стафилококки, то из посева тоже отбирают не менее 2 колоний. И лецитиназоположительные и лецитиназоотрицательные стафилококки отсевают на скошенный мясопептонный агар. После суточного инкубирования выделенную культуру изучают в мазках, окрашенных по Граму, определяя морфологию микробов и чистоту культуры. При наличии в мазке грамположительных кокков, расположенных характерными гроздьями, проводят исследование для идентификации стафилококков. Согласно генотипической классификации род Staphylococcus относится к семейству Staphylococcасеае, класс Bacilli, в которое входят также роды: Jeotgalicoccus, Macrococcocus, Nosocomiicoccus, Salinicoccus. Общими признаками для представителей этого семейства является то, что все они грамположительные кокки. Для установления принадлежности к роду Staphylococcus проводится первичная идентификация по наличию каталазы и способности ферментировать глюкозу в анаэробных условиях.

Стафилококки ферментируют маннит в анаэробных условиях (табл.10). Микрококки не ферментируют глюкозу в анаэробных условиях, так как они облигатные аэробы.

Таблица 10

Дифференциация видов стафилококков,

Выделенных от человека

Тест Вид стафилококка	Коагуляция плазмы	Продукция ДНК-азы	Продукция фосфатазы	гемолитическая активность	Расщепление маннитав анаэробных условиях	Расщепление маннитав аэробных условиях	Устойчивость к новобиоцину
St.aureus	+	+	+	+	+	+	–
St.epidermidis	–	–	+	–	–	–	–
St.saprophyticus	–	–	–	–	–	+	+
St.intermedius	+	+	?	+	–	+	–

Примечание: (+) – наличие ферментации, устойчивости, (–) –отсутствие ферментации, устойчивости

Следующим этапом исследования является видовая идентификация стафилококков, позволяющая дифференцировать St.aureus от коагулазоотрицательных видов (табл.9). Ориентировочные данные об отношении культуры к St.aureus получают при изучении характера роста на ЖСА (наличие пигмента и лецитиназная активность) (табл.10), но для окончательной идентификации изучают и другие признаки. Основным признаком, определяющим патогенность стафилококка, является способность микроба коагулировать плазму кролика или человека. Коагулазоположительные стафилококки должны рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их проверяют на чувствительность к антибиотикам.

Если выделенную культуру идентифицировать не удается или из патологического очага выделены коагулазоотрицательные стафилококки в монокультуре, у них изучают дополнительные признаки патогенности: дезоксирибонуклеазную, гиалуронидазную активность, продукцию фибринолизина, гемолизина, а также способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. После оценки всех тестов и совокупности положительных признаков делают вывод о принадлежности культуры к виду St.aureus.

Если же установлено, что выделенная культура не относится к St.aureus, проводят ее идентификацию, определяют принадлежность к видам St.epidermidis и St.saprophyticus. Для этого изучают устойчивость к новобиоцину, наличие фосфатазы и способность окислять маннит.

При эпидемиологическом обследовании в случае “госпитальных” или пищевых инфекций проводят фаготипирование выявленных культур патогенных стафилококков для подтверждения идентичности штаммов, выделенных от разных больных, предполагаемых источников инфекции и из объектов внешней среды. Для фаготипирования используют международный набор стафилофагов.

Исследование крови.

Исследование крови проводят при подозрении на сепсис. У больного асептично из локтевой вены берут кровь в объеме 10–12 мл и засевают в колбу со 100 мл сахарного бульона или в среду Китта-Тароцци. Посевы инкубируют в термостате 10 суток, производя через 2–3 дня высевы на кровяной и желточно-солевой агары для выделения чистой культуры, которую изучают и идентифицируют также, как культуры, выделенные из гноя.

7. Оценить результаты бактериологического исследования на резидентное носительство стафилококков у обследуемых по таблице 11(оформить протокол, сделать заключение)

Таблица 11

Обследуемые	Свойство стафилококков
Коагулаза	Лецитиназа	Антилизоцимная активность
А	+	+	3 мкг/мл
В	-	+	-

8. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения стафилококковых инфекций(записать в тетрадь)

Стафилококковый анатоксин. Нативный стафилококковый анатоксин является стерильным фильтратом бульонной культуры стафилококка, содержащим стафилококковый токсин, обезвреженный формалином и теплом. Используется для создания антитоксического иммунитета. Очищенный адсорбированный стафилококковый анатоксин получают из нативного путем осаждения его трихлоруксусной кислотой с дополнительной очисткой этиловым спиртом. Препарат обладает высокими иммуногенными свойствами, он стимулирует образование антитоксина, способного нейтрализовать стафилококковый токсин. Стафилококковый анатоксин применяют с целью активной иммунизации против стафилококковых инфекций: стафилодермии, послеродовых маститов, рецидивирующего фурункулеза. Для снижения заболеваемости детей первых месяцев жизни стафилококковыми инфекциями проводят иммунизацию беременных женщин. При этом у женщины возникает активный, а у ребенка – пассивный иммунитет.

Стафилококковая вакцина. Стафилококковая вакцина представляет собой взвесь стафилококков в физиологическом растворе, инактивированных нагреванием. Вакцину готовят из 10–12 коагулазоположительных культур стафилококков, выделенных от больных со стафилококковыми поражениями кожи.

Активность вакцины связана с антигенами, входящими в состав микробных клеток. Вакцинация повышает защитные силы организма, активируя фагоцитарные свойства лейкоцитов и макрофагов, стимулирует накопление комплементфиксирующих веществ, агглютининов. Вакцину применяют для специфического лечения взрослых больных при различных стафилококковых заболеваниях.

Стафилококковый антифагин. Стафилококковый антифагин представляет собой стерильный экстракт, полученный из 10–12 культур золотистых и белых стафилококков, выделенных от больных с гнойничковыми поражениями кожи. Вакцина содержит термостабильный стафилококковый антиген, способный стимулировать защитные реакции организма: увеличивается число лейкоцитов, усиливается их фагоцитарная активность, что проявляется не только в поглощении стафилококков, но и способности разрушать их, нарастает титр агглютининов. Антифагин применяют для специфического лечения взрослых и детей с гнойничковыми заболеваниями стафилококковой этиологии.

Антистафилококковая плазма. Антистафилококковая плазма представляет собой жидкую часть крови людей, содержащей стафилококковый антитоксин. Получают ее из крови доноров, иммунизированных адсорбированным стафилококковым антитоксином. Антистафилококковая плазма используется для лечения детей и взрослых, страдающих заболеваниями стафилококковой природы: сепсисом, остеомиелитом, септикопиемией, пневмонией, стафилодермией и другими локальными гнойными заболеваниями.

Иммуноглобулин противостафилококковый. Иммуноглобулин противостафилококковый представляет собой препарат гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови, содержащей повышенные концентрации стафилококкового антитоксина. Получают его из крови доноров, иммунизированных стафилококковым адсорбированным анатоксином, и плацентарной крови родильниц. Противостафилококковый иммуноглобулин используют для специфического лечения стафилококковых инфекций. Иммунотерапия тем эффективнее, чем раньше она начата.

Стафилококковый бактериофаг.Стафилококковый бактериофаг представляет собой фильтрат фаголизата стафилококков. При получении стафилококкового фага используют естественные фаги, выделенные из гнойных очагов у больных, почвы или сточных вод. Лизирующая активность стафилококкового бактериофага связана с вирулентным фагом, содержащимся в фаголизате. Стафилококковый фаг применяют для лечения стафилококковых заболеваний, как местно, в очаге инфекции, так и парентерально. Одним из условий успешного применения является введение его после определения чувствительности к нему стафилококков, выделенных от больного.

ЗАНЯТИЕ 8

ТЕМА. Стрептококки. Streptococcus. Streptococcus pyogenes. Морфология, биология, культуральные свойства, современная классификация. Стрептококковые инфекции. Роль стрептококков в этиологии скарлатины и ревматизма. Лабораторный диагноз стрептококковых инфекций. Str.pneumoniae. Морфология, биология, культуральные свойства. Роль пневмококков в патологии. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых пневмококками.

Цель занятия. Ознакомить с характеристикой стрептококков, рассмотреть схему лабораторного диагноза. Рассмотреть основные свойства пневмококков, их роль в патологии, ознакомить с методами микробиологической диагностики, рассмотреть этапы лабораторной диагностики пневмонии