Микробиологическая диагностика сибирской язвы
Основным источником инфекции являются больные травоядные животные, от которых человек заражается при непосредственном контакте, алиментарным, аэрогенным или трансмиссивным путями. Чаще всего возникает кожная форма инфекции с образованием характерного сибиреязвенного карбункула в виде уголька (anthrax), реже – кишечная, легочная, септическая формы. Методы микробиологической диагностики сибирской язвы отражены в схеме 6.
Схема 6. Микробиологическая диагностика сибирской язвы
|
|
![Микробиологическая диагностика сибирской язвы Микробиологическая диагностика сибирской язвы - student2.ru](/images/logika/mikrobiologicheskaya-diagnostika-sibirskoy-yazvy-348545-2.gif)
|
| |||
| |||
Микроскопический метод.Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных бацилл в виде цепочек дает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы (рис.11 а). В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся желто-зеленым ободком (рис. 11 б.).
Бактериологический метод -посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилен-диаминотетраацетатом (ЭДТА) и ацетатом таллия. Контаминированный материал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 370 С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы медузы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен придонный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается прозрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (расположение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выделения чистой культуры типичные колонии пересевают на скошенный МПА.
Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3%голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 370 С в атмосфере 5-7% СО2.
А б
Рис. 11. Возбудитель сибирской язвы(Bacillus anthracis). а - окраска по Граму, б – РИФ. х630
Рис. 12. Колония Bacillus anthracis. х56
Идентификацию выделенной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к антибиотикам.
Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья».На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-часовую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 370 С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные бациллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.
Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и сходных с ним бацилл отражены в табл. 7.
Наличие сибиреязвенного антигенав разложившемся трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакциитермопреципитациипо Асколи.Исследуемый материал измельчают, заливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.
Биопроба.Исследуемымматериалом подкожно заражают двух белых мышей., которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаруживают типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.
Таблица 7. Дифференциально-диагностические признаки сибиреязвенной и других бацилл
Признак | Вид микроорганизмов | |||||
Bacillus anthracis | Bacillus cereus | Bacillus mycoides | Bacillus thuringiensis | Bacillus subtilis | Bacillus Megaterium | |
Капсула | + | - | - | - | - | - |
Подвижность | - | + | - | + | + | + |
Гемолиз | - | + | - | + | - | + |
Рост в анаэробных условиях | + | + | + | + | - | - |
Лецитиназа | + | + | + | + | - | - |
Аргининдегидролаза | - | V | V | + | - | - |
Нитpaтpeдyктaзa | + | + | + | + | + | - |
Патогенность для мышей | + | - | - | - | - | - |
Ферментация до кислоты: | ||||||
глицерина | - | V | + | + | + | + |
маннита | - | - | - | - | + | + |
салицина | - | V | + | + | + | + |
Обозначения: «-« - отрицательная; «+» - положительная; «V» - вариабельная реакции.
Серологический методвыполняетсяв тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакции латекс-агглютинации и РНГА с протективным сибиреязвенным антигеном.
Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сибиреязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.