Тема: Микробиологическая диагностика гонококковых инфекций

Цель занятия:

1. Знать правила взятия и транспортировки в лабораторию исследуемого материала.

2. Знать схемы микробиологического исследования и уметь использовать микробиологические методы для диагностики гонококковой инфекции.

3. Изучить диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Ход работы:

Задание 1. Правила взятия и транспортировки в лабораторию исследуемого материала.

Так как гонококки чувствительны к внешним факторам (высушиванию, воздействиям температуры и кислорода), рекомендуется материал, полученный от пациентов, сразу инокулировать на культуральную /транспортную среду. Пробирки с инокулированным материалом должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее и оптимально пересеены на ростовую среду не позднее чем через 24 часа после взятия материала. Транспортировка материала должна осуществляться при температуре не ниже 18°C.

Материал для исследования:

· Уретра (мужчины)

· Эндоцервикс / уретра (женщины)

· Глотка

· Прямая кишка

· Конъюнктива

· Моча (мужчины и женщины)

· Вульва/ вагина (девочки)

Задание 2. Микробиологические исследования и методы для диагностики гонококковой инфекции.

Алгоритм выделения и идентификации N. gonorrhoeae

	Видовая идентификация: · Ферментативная активность · Иммунологические тесты · Молекулярно-биологические тесты

1.Бактериоскопический метод — окраска мазков двумя методами или изучение материала с помощью электронной микроскопии:

Метод 1: 1% раствор водного или леффлеровского синего или 1% раствор эозина на 60-70% спирте или 1 % водный раствор метиленового синего или 0,5 % раствором бриллиантового зеленого в течение 1 мин (по В. Н. Бедновой)

Метод 2: окраска по Граму; Метод 3: Электронная микроскопия

Промикроскопируйте предложенный материал. Сделайте вывод руководствуясь следующим постулатом:

Форма гонококка – диплококк, имеющий форму кофейного зерна и располагающийся попарно вогнутыми сторонами друг к другу. Решающее значение при микроскопической диагностике гонореи имеет учет расположения диплококков. Гонококки в основном располагаются внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток. На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток, микроскопический диагноз гонореи не ставится, требуется культуральное исследование.

Вывод:

2. Бактериологический метод: посев на питательные среды, содержащие нативные белки крови, сыворотки или асцитической жидкости; используют безасцитные среды (например, среда КДС-1 с гидролизатом казеина, дрожжевым аутолизатом и нативной сывороткой); оптимум роста в атмосфере 10—20 % углекислого газа, при рН 7,2—7,4 и температуре 37 °C.

При посеве материала, загрязненного посторонней микробной флорой, особенно из прямой кишки, рекомендуют добавлять в питательные среды 25 ЕД/мл полимиксина М и 20 ЕД/мл ристомицина сульфата. Оба антибиотика подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не оказывая влияния на рост гонококков.

Среда с полимиксином 25 ЕД/мл

Среда без полимиксина

Типичные колонии гонококков через 18–24 часа инкубации выпуклые прозрачные серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5–1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться.

Опишите результат посева, сделайте вывод.

3. Идентификация N. gonorrhoeae с помощью оксидазного теста.

Принцип метода: На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента (тетраметил-p-фенилендиамина, 1%-ный водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, обычно в течение 5–10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным.

Исследуемая культура без оксидазного реагента

Исследуемая культура с оксидазным реагентом

Опишите результат реакции, сделайте вывод.

4. Идентификация N. gonorrhoeae по биохимической активности.

Запишите таблицу: Ферментативная активность бактерий рода Neisseria

Виды нейссерий	Глюкоза	Мальтоза	Лактоза	Сахароза
N. gonorrhoeae	+	-	-	-
N. meningitidis	+	+	-	-

5. 1). Иммунологический метод: РСК (реакция Борде-Жангу) с сывороткой крови больного.

Учёт оценка результатов РСК с сывороткой больных с подозрением на хроническую гонорею.

Исследованы группы пробирок 2-х обследуемых с подозрением на хроническую гонорею:

1 больной: При исследовании пробирок выявлена отрицательная реакция при достоверных контролях, что свидетельствует о том, что антитела не выявлены и серологический клинический диагноз не подтверждается.

2 больной: При исследовании пробирок выявлена положительная реакция при достоверных контролях, что свидетельствует о наличии антител и серологическом подтверждении клинического диагноза - хроническая гонорея.

К+ К- №1 №2 KAГ КК KГС КЭ

К+ положительный контроль; К- отрицательный контроль; №1, №2 номера образцов; КАГ контроль антигена; КК контроль комплимента; КГС контроль гемолитической сыворотки; КЭ контроль эритроцитов.

Зарисуйте реакцию, сделайте вывод:

2). Иммунологический метод: ИФА (иммуноферментный анализ) используется для определения иммуноглобулинов, антигенов и гормонов.

Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая составляет 90%. Материалом для исследования служит сыворотка венозной крови, взятой натощак.

3). Иммунологический метод экспресс диагностики: "Гонорея Стик" выявление антигенов Neisseria gonorrhoeae в урогенитальных образцах и моче

Иммунологический метод экспресс диагностики: NGH Gonorrhea Test Kit выявление антигенов Neisseria gonorrhoeae в урогенитальных образцах и моче

К О

Задание 3. Изучить препараты, используемые для специфической профилактики, терапии и диагностики гонококковой инфекции.

1. Гонококковая вакцина содержит взвесь инактивированной культуры гонококков в 0,9 % растворе натрия хлорида. Применяется для диагностики (установления излеченности гонореи) и как вспомогательный метод лечения гонококковой инфекции наряду с другими видами терапии

2. Гоноаллерген иммунологически активный белок, выделенный из Neisseria gonorrhoea. Применяется для постановки кожно-аллергических проб (экспресс-диагностика).

Список литературы:

1. Кубанова А.А., Фриго Н.В., Савичева А.М., Соколовский Е.А.,Брилене Т., Дэак Д., Баллард Р., Исон К., Халлен А., Домейка М., Унемо М.Протоколы лабораторной диагностики гонорейной инфекции //Непрерывное профессиональное образование/Vestn. Dermatol. Venerol. 2008; 1: 83–97

2. Alexander, S., and C. Ison. 2005. Evaluation of commercial kits for the identification of Neisseria gonorrhoeae.// J. Med. Microbiol. 54: 827–831.

3. Unemo, M., A. Savicheva, O. Budilovskaya, E. Sokolovsky, M. Larsson,and M. Domeika. 2006. Laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St Petersburg, Russia: inventory, performance characteristics and recommended optimizations // Sex. Transm. Infect. 82: 41–44.

4. Приказ Минздрава СССР от 22.04.85 № 535 Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. По состоянию на ноябрь 2007 года.

5. Л.Д. Кунцевич, Н.К. Никулин, ПИ. Жукова, В.Р Мишанов Применение препарата из гонококков в качестве индуктора биохемилюминесценции при изучении реактивности нейтрофилов периферической крови // ЗППП 1998г, N3, 24-27.