Классификация сред, терминология

Большинство существующих классификаций сред достаточ­но условно и не всегда обосновано, что отмечается и самими ав­торами (Семенов С. М., 1990 и др.).

По составу микробиологические среды подразделяются на ес­тественные (натуральные), искусственные (полусинтетические) и синтетические (Блинов Н. П. и соавт., 1988; Семенов С. М., 1990). Однако Федоров Р. В. (1990), характеризуя состав сред, использу­ет термины «безбелковые», «белковые» и «минеральные», а деление на естественные и искусственные, на его взгляд, это классифика­ция по происхождению.

По консистенции среды могут быть жидкими (бульоны), полу­жидкими (с добавлением 0,3—0,7% агара), полуплотными, плот­ными (1,5—2% агара), а также, по классификации Блинова Н. П. и соавт. (1988), сыпучими и сухими. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в мик­робиологической и медицинской промышленности. Это разва­ренное пшено и кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. Сухие среды представляют собой гигроскопические порошки или гранулы с влажностью до 10%. Гранулированная форма имеет ряд преимуществ по сравнению с порошкообраз­ной: при работе с ней образуется меньше мелкодисперсной пы­ли, которая может вызвать аллергические реакции; кроме того, гранулы не прилипают к стенкам сосудов, облегчая, тем самым, взятие навесок; быстро пропитываются водой и образуют рас­творы, не содержащие комочков (Подунова Л. Г. и соавт., 1996). Часто используются в качестве синонимов термины «твердые», «полутвердые», «мягкие». В некоторых случаях для уплотнения сред применяется желатин (10—15%) и силикагель. Ряд естест­венных питательных сред (свернутые сыворотка крови, яичный белок) сами по себе являются плотными (Борисов Л. Б. и соавт., 1993).

По целевому назначению среды делятся на основные (пита­тельные основы), элективные и дифференциально-диагностиче­ские (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). Лабинская А. С. (1978) подраз­деляет среды по этому принципу на общего назначения и специаль­ные, относя к последним элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические. Под средами общего на­значения фактически рассматриваются питательные основы: мя-со-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) и др. В то же время Федоров Р. В. (1990), опираясь на данный крите­рий, выделяет среды обычные или простые, специальные или элек­тивные и дифференциально-диагностические. Таким образом, дифференциально-диагностические среды по непонятным, во всяком случае для нас, соображениям выделяются им из специ­альных сред в самостоятельную группу. Семенов С. М. (1990) по назначению среды разделяет на дифференциально-диагностиче­ские, элективные, накопительные (обогащения, накопления), ингибиторные, селективные, индикаторные и консервирующие (транспортные).

Виестур У. Э. и соавт. (1980) классифицируют питательные среды по назначению на диагностические и производственные. Первые предназначены в основном для обнаружения, выделения и идентификации патогенных микроорганизмов по морфологи­ческим и биохимическим признакам и, в свою очередь, делятся на элективные, обогатительные, консервирующие и дифферен­циально-диагностические. Производственные среды подразде­ляются по составу на посевные и основные ферментационные, приготовленные в большинстве случаев на полупродуктах и от­ходах сельскохозяйственного и пищевого производства с добав­ками минеральных солей.

Требования к производственным средам: максимальный вы­ход продукции (в частности, токсинов и др.) и бактериальной массы, дешевизна. Проблемой является загрязнение бактериаль­ной массы компонентами культуральной среды, в частности бел­ками сыворотки крови, вынуждающее использовать многократ­ное отмывание и концентрирование.

На наш взгляд, по целевому назначению среды можно было бы классифицировать как культуральные, дифференциально-диаг­ностические, производственные и специальные.

Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С. (1981), Блинов Н. П. и со­авт. (1988) подразделяют среды на 4 группы: универсальные (обычные или простые, по терминологии Блинова Н. П. и соавт., 1988) специальные, избирательные (элективные) и дифференциаль­но-диагностические. При этом «универсальные» (по терминоло­гии Пяткина К. Д., Кривошеина Ю. С., 1981) и «основные» (по терминологии Борисова Л. Б. и соавт., 1993) среды фактически представляют собой одну и ту же группу.

В «Руководстве по микробиологии, клинике и эпидемиоло­гии инфекционных болезней (М., 1962) диагностические среды

б

делятся на консервирующие, обогащения, элективные и дифферен­циально-диагностические.

В более позднем «Руководстве по микробиологической ди­агностике инфекционных болезней» (М., 1973) среды делятся на 3 группы: 1. для культивирования, включающие универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования; 2. для выделения и накопления, включающие среды консервирую­щие, накопления и элективные; 3. для идентификации, включаю­щие дифференциальные и элективно-дифференциальные.

Дифференциально-диагностические среды—предназначены для разграничения отдельных видов или групп микроорганиз­мов. Принцип их построения основан на видовом различии в биохимической активности бактерий вследствие неодинакового набора ферментов (Борисов Л. Б. и соавт., 1993), а также по культуральным свойствам (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В состав этих сред входят: питательная основа, обеспечи­вающая размножение бактерий; определенный углевод, различ­ное отношение к которому является диагностическим призна­ком данного вида бактерии; цветной индикатор рН (например, индикатор Андреде), свидетельствующий о сдвиге рН в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относят среды для опреде­ления протеолитической, гемолитической и восстановительной (редуцирующей) способностей микробов, ферментации углево­дов, а также среды, содержащие вещества ассимилируемые только определенными микробами.

К группе дифференциально-диагностических относят и се­лективные среды, предназначенные для дифференциации про-то- и ауксотрофных бактерий (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981).

Рекомендуется 5 критериев для оценки селективных сред Mossel D. (1986). Продуктивность—соотношение между коли­чеством колоний выделяемого вида бактерий, выросших на се­лективной среде с и без селективных агентов. Селективность— соотношение между количеством колоний ингибируемых ви­дов бактерий выросших на селективной среде с и без селективных агентов. Дифференциабельность (элективность)— способность легко различать на селективной среде колонии разных видов бактерий. Действенность—выделение при ис­пользовании данной селективной среды из образцов искомых видов бактерий и ингибирование сопутствующих. Системати­ческая необъективность—пределы, в которых использование данной селективной среды ограничивает выделение из образ­цов того или иного вида бактерий или биотипа искомой груп­пы, или вида бактерий.

В универсальном варианте селективная среда должна удовле­творять следующим требованиям: обеспечивать рост 100% штам­мов конкретного вида микроорганизма, даже при наличии еди-

ничных клеток в пробе; полностью подавлять рост любых видов сопутствующей микрофлоры; не изменять видовые свойства ис­следуемого микроорганизма; быть простой в изготовлении и не содержать дефицитных или дорогостоящих компонентов (Рожа-вин М. А., Бугаева Е. И., 1986).

Элективными называются среды для избирательного выделе­ния и накопления микроорганизмов определенного вида или группы из материалов, содержащих разнообразную посторон­нюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологиче­ских особенностей конкретных микроорганизмов, отличающих их от большинства других. Например, избирательный рост ста­филококков наблюдается при повышенной концентрации NaCl, холерного вибриона—в щелочной среде и т. д. (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относятся среды обогащения (накопления, enrichment), в которых интересующий исследователя вид рас­тет интенсивнее и быстрее сопутствующей микрофлоры (Пят-кин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В свою очередь, Кали­на Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) в обзоре, касающемся Ps. aerugi­nosa, подразделяют среды накопления на неселективные и инги-биторные.

Специальные среды—предназначены для выращивания бакте­рий, не размножающихся на «универсальных» («основных») сре­дах. К ним относятся кровяной агар, сывороточные агар и бульон и др. Как специальные, очевидно, можно рассматривать и вос­становительные среды, а также среды для определения антибиоти-кочувствительности микроорганизмов. К последним относятся агар АГВ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и его зарубеж­ные аналоги—агары Мюллера-Хинтона и ИзоСенситест. К сожалению переход в ближайшем будущем микробиологических лабораторий нашей страны к использованию агара Мюллера-Хинтона, в соответствии с наиболее часто применяемыми в меж­дународной практике стандартами Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) не представляется возможным (Козлов Р. С. и соавт., 1996).

Краткую инструкцию по классификации питательных сред, значению отдельных ингредиентов, входящих в них, их пригото­влению и хранению предлагает Kreuzer К. (1994).

Питательные основы

Каждый ингредиент питательных сред оказывает то или иное влияние на микроорганизмы и изучение стимуляции и ингиби-рования их жизнедеятельности компонентами среды имеет важ­ное значение, в том числе для разработки процессов культивиро­вания при получении бактериальной массы с заданными свойст­вами и продуктов вторичного метаболизма (Мельникова В. А. и соавт., 1991).

К наиболее часто используемым компонентам микробиоло­гических сред относятся питательные основы животного и рас­тительного происхождения, агар-агар, красители, антибиотики, сыворотка крови, минеральные соли и твины.

При изготовлении питательной основы микробиологических сред предлагается масса источников белка—возможных замени­телей мяса. В настоящее время мясные основы в большинстве случаев уступили место казеину и продуктам его переработки, которые применяются в составе питательных сред уже многие годы (Смирнова Г. А., 1991).

Еще в 1949 году Чанпалов П. Ф. рекомендовал использовать для этих целей отходы рыбной промышленности. Предлагают­ся кровяно-дрожжевые автолизаты (Васильева 3. И. и соавт., 1972; Стефанов А. В. и соавт., 1975; Тароков М. И. и соавт., 1980). Как источники белка рекомендуются куриные эмбрио­ны, обрат молока и казеин (Иванов М. М., Михайлов Н. А., 1977; Лопатнев С. В., Клейнер Г. И., 1979), а также растительное сырье, например водоросль хлорелла (Гесландзе К. Д., 1978; Че-ренкова Е. П., Ефимова Т. П., 1979), горох, сою, плоды тунгово­го дерева (Гизитдинов Н. Н., 1981) и даже навоз (Афанасов Э. Э. и соавт., 1977; Сведенцов Л. М. и соавт., 1978). Более современ­ные источники по использованию немясных питательных ос­нов животного и растительного происхождения представлены в обзоре Смирновой Г. А. (1991).

Обоснована возможность применения в качестве белковой основы питательных сред гидролизатов отходов переработки сы­воротки крови животных (фибрина, отходов изготовления пре­паратов иммуноглобулинов и их смеси) (Шептун Н. Г, 1989) и кровяных сгустков (Голиков А. В. и соавт., 1987).

Мельник В. П., Медковская Р. Л. (1992) рекомендуют с целью упрощения процесса получения белковой основы сред и ее уде­шевления использовать обварочный бульон мясокомбинатов, полученный из субпродуктов второй категории, и подщелачи­вать его 2,5—8,5 г/л сульфатом алюминия.

Шиловская Т. Е., Литвинец Е. Н. (1992) предлагают го­товить питательную основу микробиологических сред, добав­ляя к стабилизированной крови животных, используемой в ка­честве исходного сырья, смесь хлористоводородной и муравьи­ной кислот, нейтрализуя полученную смесь гидроокисью ка­лия, и добавляя, в заключение, осветленную молочную сыворотку.

Сравнительное исследование, проведенное Смирновой О. А., Давыдовой Н. А. (1987), показало сопоставимость биологиче­ских свойств гидролизатов биомассы Е. coli и рыбного, широко применяемого в бактериологии. Ростовые свойства сред для ди­агностики кишечных инфекций, приготовленных на основе гид-ролизата Е. coli, были даже несколько выше таковых, приготов­ленных на рыбном гидролизате. Дешевизна и доступность исход-

ного сырья дают основание полагать, что гидролизат кишечной палочки можно использовать для частичной замены сред, полу­чаемых из мясных и рыбных продуктов.

Сорокин В. Г. и соавт. (1996) разработали технологию про­мышленного получения дрожжевого экстракта, содержащего 40—50% свободных аминокислот, витаминов (группы В, РР), ми-кро-и макроэлементов, биологически активных веществ (холин и др.). Его эффективность в качестве азотно-витаминной основы бактериологических сред превышала стандартные препараты пептонов, мясной воды, переваров Хоттингера, Мартена и др.

Доценко В. В. и соавт. (1995, 1996) разработали и испытали сухой белковый концентрат в качестве основы бактериологиче­ских питательных сред, в частности для культивирования P. mul-tocida шт. АВ и Sal. cholera suis шт. 177 и № 9. Ростобеспечиваю-щая способность сред на его основе для культивирования Е. coli, St. aureus, Str. faecalis, а также тест-микробов для контроля сте­рильности биопрепаратов С. diptheroides, Str. scarlatinae, CI. oede-matiens почти в 2 раза превышала этот показатель на мясной ос­нове. Культивирование на средах с данной основой производст­венных штаммов рожи свиней, сальмонелл, пастерелл, бруцелл, кишечной палочки сопровождалось в 1,5—2 раза большим нако­плением бактериальной массы, чем в контроле, с основой из мясного гидролизата.

Важным показателем, характеризующим степень пригодно­сти той или иной белковой основы в составе конкретной среды, является содержание углеводов. Так, белковая основа должна быть свободна от углеводов в средах, предназначенных для диф­ференциации и идентификации микроорганизмов по их фер­ментативной активности в отношении того или иного углевода. С другой стороны, для успешного культивирования ряда микро­организмов требуется наличие в среде определенных количеств углеводов. Высоким содержанием последних отличаются гидро-лизаты кормовых дрожжей. Пептоны (семипалатинский и «Dif-со») характеризуются достаточно низким количеством углеводов (Гавристова И. А., Бендас Л. Г., 1991).