Pseudomonas (Burkholderia) mallei

Возбудитель сапа — вызывает контагиозное зоонозное заболевание человека и животных, протекающее по типу септикопиемии с образованием специфических гранулем и абсцессов (сапных узелков) и проявляется язвенным ринитом и лимфаденитом, гнойно-некротическим поражениями кожи. В основном сап поражает лошадей, мулов и ослов.

Морфология и тинкториальные свойства

Тонкие, слегка изогнутые палочки с закругленными концами размером 2-3´0,5-1 мкм; при выращивании in vitro склонны к полиморфизму (образуют более мелкие формы либо цепочки); неподвижны; спор не образуют. Окрашиваются анилиновыми красителями (часто окрашиваются биполярно).

Культуральные свойства. Растет на простых средах, дополненных 4-5% глицерина; растет в интервале 20-45°С (оптимум 37°С); оптимум рН 6,5-7,2. Строгий аэроб.

На жидких средах (например, МПБ с глицерином) первоначально образует мутную взвесь, а со 2-х суток начинает формировать пристеночный осадок и пленки; затем культура выпадает в осадок, образующий при вращении пробирки тяжи, поднимающиеся кверху. С поверхностной пленки на дно спускаются пленки. При хранении среда полностью не просветляется.

На полужидких средах (например, на желатине) наблюдают поверхностный сероватый налет, прорастающий в верхнюю часть линии укола (иногда в месте укола наблюдают желтоватое окрашивание); желатин не разжижается.

На плотных средах (например, агаре с глицерином) образует плоские полупрозрачные колонии, сливающиеся в прозрачный янтарный тягучий налет. На свернувшейся сыворотке образует мелкие мутные беловатые колонии (среду не разжижает). Дает характерный рост на картофельных пластинках — через 24 ч образует полупрозрачные колонии, позднее (через 6-8 суток) они сливаются, образуя полупрозрачные массы цвета меда (пигментирование проявляется только на картофельных средах и варьирует от сероватого до буровато-красного). Независимо от цвета налета колонии сохраняют прозрачность. Пигментообразование возможно только на картофельной среде.

Биохимия. Некоторые штаммы разлагают глюкозу, маннит, левулезу, глицерин с синтезированием кислоты без газа; палочки не синтезируют индол и не восстанавливают нитраты. Синтезируют H2S и аммиак на жидких средах; каталазо-положительны. Молоко свертывают медленно (10-12 суток), образуя незначительное количество кислоты; пептонизацию молока не вызывают.

Лабораторная диагностика

Основывается на выделении и идентификации возбудителя (рис. 12), а также на результатах кожных проб.

Все исследования проводят в условиях, необходимых для работы с возбудителями особо опасных инфекций. Для исследования забирают мокроту, гной, кровь и отделяемое вскрывшихся абсцессов или биопрепараты закрытых абсцессов. При невозможности немедленного проведения анализа материал консервируют внесением 30% раствора глицерина (хранить следует не более 10-15 суток при температуре 4°С). Для подавления роста прочих микроорганизмов в среды вносят красители, например основной и кислый фуксин (1:100000), кристаллический фиолетовый (1:200000), бриллиантовый зеленый (1:1000000). При выделении подозрительных колоний проводят биологическую пробу на морских свинках (также можно использовать хомяков и кошек). Смешанную культуру вводят подкожно, чистую — внутрибрюшинно. На месте введения через 2-3 суток образуется опухоль-узелок, вскрывающаяся на 4-5 сутки с образованием язвы. На 3-10 сутки у морских свинок-самцов, зараженных внутрибрюшинно, развивается характерное поражение яичек (феномен Штрауса). Следует помнить, что феномен не патогномоничен для заболевания, и его можно вызвать заражением животных Pseudomonas aeruginosa, P. pseudomallei и другими микроорганизмами. Основные дифференцирующие признаки возбудителя: неподвижность, отсутствие способности образовывать газообразный азот, разжижать желатин и расти при температуре 42°С.

Аллергическая проба. В 1891 г русские ветеринарные врачи Х. Герман и О. Кальнинг предложили средство диагностики сапа – маллеин. При подозрении на сап больному внутрикожно (конъюнктивально) вводят маллеин (бактериальный аллерген, полученный из культур Pseudomonas mallei); реакция имеет больше эпидемиологическое, эпизоотическое значение, т.к. у больного положительная воспалительная реакция развивается на 2-3 неделе заболевания.

Серологические исследования. Наличие AT в сыворотке больных выявляют РА со специальным штаммом (ориентировочная концентрация микроорганизмов в суспензии не менее 1 млрд/мл), РСК (основная диагностическая реакция) и РНГА.

Рисунок 17. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителя сапа

Тема № 24. Семейство Enterobacteriaceae.

Цель занятия: Усвоить правила отбора и пересылки патологического материала в лабораторию, порядок и методику исследования его для выделения и идентификации возбудителей сальмонеллезов.

Материалы и оборудование: Посевы, сделанные студентами на прошлом занятии; питательные среды МПА, МПБ, агар Эндо, среды Левина, среда с лактозой, среды индикаторные для определения индола и сероводорода. Биопрепараты.

Пo последней классификации (1984) включает 14 родов бактерий,имеющих сходство по морфологическим, тинкториальными культуральным свойствам и отличающихся по ферментативным (биохимическим) признакам. Наибольшее значение в практической работе ветеринарного врача имеют poд Escherichia и Salmonella, вызывающие соответственно эшерихиозы и сальмонеллезы у животных и человека.

Возбудитель эшерихиозов (колибактериоза,отечной болезни свиней) — Е. coli (кишечная палочка). Важно провести правильный отбор патологического материала для бактериологического исследования, учитывая, что при разной форме течения болезни локализация возбудителя в тех или иных органах бывает различной. Поэтому приводим краткую характеристику колибактериоза (эшерихиоза). Это остропротекающее инфекционное заразное заболевание молодняка разных видов животных (включая птиц и пушных зверей). Характеризуется, как правило, диареей (профузным поносом), обезвоживанием организма, депрессией, нарастающей слабостью и смертельным исходом. Колибактериоз протекает в трех формах: септической, энтеротоксемической и энтеритной. При последних двух формах сепсис отсутствует. Телята восприимчивы первые часы и дни после рождения; поросята заболевают как в период новорожденности, так и после отъема. Кроме того, у поросят встречается еще одна форма эшерихиоза — отечная болезнь. Ягнята заболевают с первых дней после рождения до 5—6-месячного возраста. Птица поражается в основном в первые 2—4 мес. Взрослые животные колибактериозом не болеют, но являются бактерионосителями патогенных штаммов Е. coli. Кишечная палочка может быть также возбудителем эндометрита и мастита у коров.

Патологический материал. Свежий труп или трубчатая кость, доля печени с желчным пузырем, селезенка, почка, сердце у аорты, перевязанное лигатурой, брыжеечные лимфоузлы, отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанного с двух сторон (упаковка отдельно от остального материала). В лаборатории при вскрытии трупа теленка поросенка, ягненка), помимо указанного материала, исследуют еще и головной мозг. Трупы (целиком) направляют в лабораторию в водонепроницаемой таре. Если не представляется возможным доставить материал в кратчайший срок (4 ч), его консервируют (кусочки органов) стерильным 30 %-ным водным раствором глицерина или 10 %-ным раствором NaCl. В лаборатории материал исследуют в порядке, указанном на рисунке 73, соблюдая правила асептики: проводят посевы на питательные среды — МПБ, МПА, среды Эндо или Левина. В пробирки со средами посевы проводят пастеровскими пипетками (2—3 капли), а на плотные питательные среды в чашках Петри материал наносят шпателем. Кроме того, посевы из печени, почки, лимфоузлов, селезенки и головного мозга осуществляют методом отпечатков на поверхности агара в чашках (Эндо и др.). Для этого, придерживая стерильным пинцетом, стерильными ножницами вырезают кусочек ткани, фламбируют его и разрезанной поверхностью касаются поверхности среды. Посевы помещают в термостат. После посевов из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки из печени, селезенки, крови из сердца, фиксируют и окрашивают по Граму.

Микроскопия. Определяют морфологические и тинкториальные свойства. На препаратах «висячая капля» устанавливают подвижность (или ее отсутствие) у бактерий. Чаще Е. coli — подвижный микроб (перитрих), но встречаются и неподвижные варианты. Форма его палочковидная с закругленными концами, окрашивается грамотрицательно (розово-красный цвет), споры не образует; длина микробной клетки 1—3 мкм, ширина — 0, 8 мкм. Располагаются бактерии одиночно. Капсулу не образует, за исключением отдельных штаммов серогрупп 08, 09, 0101. После инкубирования засеянных пробирок и чашек Петри в термостате выросшие культуры бактерий вновь просматривают под микроскопом. Типичные колонии на средах Эндо (или Левина) пересевают для получения чистой культуры в пробирках с МПБ и МП А. Полученную чистую культуру пересевают на специальные дифференциально-диагностические среды для определения биохимических и антигенных свойств возбудителя колибактериоза (посредством РА), а также его патогенности (биопробой).

Культуральные свойства. Е. coli хорошо растет на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах. Оптимальная температура роста 37—38 °С, рН среды 7, 0—7,2. По типу дыхания — аэроб (и факультативный анаэроб). В жидкой среде рост эшерихий проявляется в виде равномерного помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка. На МПА через 16—20 ч вырастают влажные, круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью, сероватого цвета. Существуют штаммы E.coli, обладающие гемолитическими свойствами (вокруг колонии на кровяном агаре проявляется зона гемолиза). Для установления родовой и видовой принадлежности культур большое значение имеет выявление биохимических свойств. С этой целью чистую культуру высевают на ряд специальных сред.

Ферментные (биохимические) свойства. На среде Эндо в чашках Петри Е. coli растет в виде малиново-красных (розовых) колоний. Это объясняется тем, что кишечная палочка сбраживает лактозу, содержащуюся в среде, при этом образуется молочная кислота, под действием которой происходит восстановление цвета фуксина, также входящего в состав среды, но обесцвеченного сульфитом натрия (Na2S03). Глюкозные и лактозные среды с ндикатором E.coli, сбраживает, и среда в пробирках становится розового или красного цвета. Встречаются лактозонегативные штаммы (вариант) Е. coli, не сбраживающие лактозу. Многие штаммы ферментируют маннит, дульцит. Е. coli образует индол, не образует H2S, дает положительную реакцию с метиловым красным (среда окрашивается в розово-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса — Проскауэра (среда окрашивается в желтый цвет). Последние две пробы ставят с двухсуточной культурой, выращенной на среде Кларка (раствор пептона, глюкозы, двухфосфорнокислого калия в дистиллированной воде). В пробирку с культурой на среде

Кларка пипеткой добавляют 5 капель спиртового раствора метилового красного, пробирку встряхивают. При ферментации глюкозы происходит розовое окрашивание, при отсутствии ферментации углевода — желтое окрашивание, отрицательный результат. В другой пробирке с культурой на среде Кларка проводят пробу Фогеса — Проскауэра: добавляют 0, 2 мл 40 %-ного КОН и 0, 5 мл 6 %-ного спиртового раствора альфа-нафтола, учитывают результат черезЗ— 5 мин. Если культура сбраживает глюкозу с образованием ацетил-метилкарбинола, последний с индикатором дает розовое окрашивание, положительный результат. На жидкой синтетической среде Козера и плотной среде Симмонса с индикатором бромтимолблау E.coli не растет потому, что не усваивает цитратно-аммонийные соли сред. Е. coli желатину