Лабораторная диагностика гриппа
Национальная медицинская академия последипломного образования имени П.Л. Шупика
Учитывая значительное распространение гриппа и возникновение ежегодных эпидемий, методам диагностики этой инфекции уделяют особое внимание. К последним относятся:
экспресс-диагностика вируса гриппа;
классическое выделение вирусов гриппа с их идентификацией;
серологическая диагностика;
o выявление антител к вирусу гриппа в сыворотке крови больных.
Лабораторная диагностика гриппа осуществляется с целью:
этиологической диагностики случая респираторного заболевания, то есть лабораторного подтверждения клинического диагноза "грипп" (применяются все перечисленные методы, приоритетной является экспресс-диагностика);
определения этиологии эпидемии или пандемии гриппа (вирусовыделение);
прогнозирования следующих эпидемий гриппа (вирусовыделение, серологические методы);
определения иммуноструктуры населения в межэпидемический период и накануне эпидемии (серологические методы);
определения напряженности послевакцинального иммунитета (серологические методы);
осуществления экологических исследований, то есть определения распространенности вирусов гриппа среди птиц различных видов, млекопитающих и других естественных резервуаров возбудителя.
Экспресс-диагностика
Метод флюоресцирующих антител (МФА, прямой метод Кунса) является довольно надежным методом быстрой диагностики гриппа, позволяющим обнаружить антигены вируса гриппа непосредственно в клиническом материале через 2-3 ч от момента его взятия. МФА исследуют клетки цилиндрического эпителия слизистой оболочки в участке нижней носовой раковины и задней стенки глотки, которые отбирают сухими ватными тампонами и помещают в среду для транспортировки вирусов. В лаборатории тампоны встряхивают, отжимают и удаляют, а взвесь центрифугируют на протяжении 20 мин со скоростью 3 тыс. об./мин. Из осадка клеток готовят мазки на обезжиренном предметном стекле.
Для выявления антигенов вируса гриппа в пробах секционного материала делают отпечатки кусочков ткани легкого, а также готовят препараты со слизистой оболочки трахеи и бронхов, соскребая клетки эпителия или плотно прижимая участок пораженной слизистой оболочки к стеклу. Из каждого образца исследуемого на грипп материала делают по 3 мазка на стекле.
На подсушенные и зафиксированные (например, холодным ацетоном) препараты исследуемых клеток наносят специфические гипериммунные люминесцентные сыворотки к вирусам гриппа А(Н1N1), A(H3N2) и В. После 30-минутной инкубации предметные стекла тщательно промывают буфером, подсушивают и осуществляют микроскопическое изучение клеток с помощью люминесцентного микроскопа.
Локализация и характер свечения антигена вируса зависят от стадии развития возбудителя в клетке, а также от срока возникновения гриппозной инфекции. В первые 3 дня заболевания антиген чаще локализуется в ядрах клеток цилиндрического эпителия при одновременном диффузном или гранулярном свечении цитоплазмы в той же или в разных клетках. Часто определяется равномерное гомогенное свечение всей клетки с плохой дифференциацией ее внутренней структуры.
При затухании инфекционного процесса свечение преимущественно наблюдается в цитоплазме или в отдельной ее части в виде гранул.
При сопоставлении количества пораженных клеток, находящихся в поле зрения люминесцентного микроскопа, и срока течения гриппа отмечено их повышение (6-10) в первые 3 дня заболевания.
Диагностически значимым является специфическое свечение пяти и более клеток цилиндрического эпителия с яркостью не менее чем 2 .
Иммуноферментный анализ (ИФА) позволяет обнаружить рибонуклеопротеиновый родоспецифический антиген вируса гриппа в носоглоточных секретах больных острой респираторной инфекцией. Разработаны отдельные тест-системы ИФА для диагностики гриппа А и В, то есть клинический материал исследуется с помощью двух тест-систем одновременно. ИФА в данном случае может применяться для этиологической диагностики случая респираторной инфекции или для скрининга клинических материалов перед вирусовыделением. Однако этот метод не позволяет выявить штаммовую специфичность возбудителя гриппа.
Материалом для исследования служат выделения из носовой полости больных респираторной вирусной инфекцией, получаемые путем аспирации секретов с помощью аспирационных емкостей, соединенных с вакуумным насосом. Отобранные секреты разводят в 5 раз фосфатно-солевым буферным (ФСБ) раствором с 0,05% твина-20. Для ИФА-диагностики гриппа допускается использование и носоглоточных мазков. При этом ватные тампоны со слизью и клетками ресуспендируют в 2 мл ФСБ с 0,05% твина-20, а перед исследованием двукратно замораживают-размораживают для выделения вирусных антигенов из клеток. Подготовленные клинические материалы можно сохранять на протяжении 3-4 мес. при температуре - 15-20°С.
ИФА базируется на выявлении антигенов вирусов гриппа А и В с помощью моноклинальных (МК) антител к рибонуклеопротеину (РНП) соответствующих возбудителей в сендвич-варианте: противогриппозные МК антитела адсорбируют в лунках планшета, после чего к ним последовательно добавляют контрольный и исследовательский материалы, а после соответствующей экспозиции - конъюгант специфических МК антител с пероксидазой хрена. Образованный иммунный комплекс: МК - антитела к РНП вирусов гриппа А/В - РПН-антигены вирусов гриппа А/В - меченные пероксидазой МК-антитела к РНП вирусов гриппа А/В выявляют добавлением субстратной смеси, в состав которой входят перекись водорода (субстрат пероксидазы) и ортофенилендиамин (краситель). После определенной экспозиции (до появления желтой окраски в лунках с положительными контрольными образцами) ферментную реакцию останавливают серной кислотой. При проведении каждого этапа ИФА лунки планшета перед добавлением следующего компонента промывают буферным раствором.
Результаты рассчитывают с помощью автоматизированных спектрофотометров (ридеров) при длине волны 490 нм, определяя показатели оптической плотности смеси в лунках планшета. При этом учитывают коэффициенты, указанные в инструкции к тест-системе, позволяющие рассчитать оптическую плотность, выше которой исследовательские образцы считаются положительными.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод геномолекулярного исследования клинических и секционных материалов, который может применяться для экспресс-диагностики гриппа. Однако чаще ПЦР-метод используется для широкого спектра экологических исследований на грипп. В основе метода - выявление в исследовательских образцах генетических последовательностей определенных вирусов гриппа и их амплификация к сотням миллионов копий, идентифицируемых методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) или гибридизационно-иммуноферментным анализом. В нашей стране ПЦР пока что не нашла широкого применения в практической инфектологии.
Иммунохроматографический анализ (ИХА), или быстрые тесты. Материалом для исследования являются носоглоточные смывы, которые наносят на нитроцеллюлозный фильтр с определенными иммунными ингредиентами, заправленный в пластиковую кассету. Результат исследования учитывают через 5-15 мин. При наличии антигенов вируса гриппа проявляются две красные полосы, одна из которых контрольная.
^ Выделение вирусов гриппа. Отбор материала для выделения вирусов
Исследуемым материалом являются мазки из носа, зева и задней стенки глотки, смывы из носовой части глотки, секционный материал (фрагменты трахеи, бронхов, легких). Иногда для выделения вирусов используют кровь и спинномозговую жидкость.
Оптимальным сроком отбора клинического материала являются первые 2-3 сут от начала заболевания.
Для транспортировки отобранного материала в лабораторию используют среду с белковым стабилизатором, способствующим более длительному сохранению инфекционной активности вируса гриппа. Это может быть раствор Хенкса или среда 199, Игла с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) или с 0,5% желатина, или даже с 0,5% снятого (обезжиренного) молока. Можно применять забуференный физиологический раствор - 0,01 М фосфатно-буферный раствор, рН 7,2-7,4 0,15 М натрия хлорида с 0,5% БСА.
Перед выездом за исследуемым материалом среду разливают в пробирки или флаконы по 0,5 мл, добавляют по 400 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл неомицина, 100 мкг/мл микостатина.
Секреты слизистых оболочек из носа и горла больных берут сухими стерильными ватными (марлевыми) тампонами, которые затем погружают в пробирку со средой, закрывают пробкой, маркируют и доставляют в лабораторию в термосе со льдом, не допуская замораживания.
В лаборатории тампоны выжимают в центрифугальную пробирку со средой, центрифугируют 20 мин при 2-3 тыс. об./мин и температуре 4°С. Избыточный осадок используют для выделения вируса гриппа.
Обязательному вирусологическому исследованию подлежит секционный материал от умерших с диагнозом "пневмония" или "острая респираторная инфекция". Для исследования отбирают кусочки легких без признаков геморрагии и некроза, фрагменты трахеи и соскоб с нее. Материал помещают в стерильную посуду со смесью равных частей глицерина и забуференного физиологического раствора и оставляют при температуре 4°С на сутки. Перед исследованием кусочки тканей дважды отмывают в чашках Петре стерильным физиологическим раствором, измельчают ножницами и растирают в стерильной ступке с песком, постепенно добавляя физиологический раствор до образования 20-30% суспензии. Последнюю центрифугируют при 10 тыс. об./мин в течение 20 мин, избыточный осадок используют для выделения вируса гриппа.
Методы повышения эффективности изоляции выделения вируса гриппа:
1. Обработка исследуемого материала равным объемом 0,25% раствора трипсина для усиления инфекционной активности вирусов (протеолитической активации гемагглютинина).
2. Концентрация с помощью адсорбции на куриных эритроцитах. Для этого к исследуемому материалу, осветленному фильтрованием сквозь четырехслойный марлевый фильтр, добавляют равный объем стерильной 2% суспензии эритроцитов морской свинки. Смесь встряхивают и оставляют при перемешивании в ледяной бане на 20 мин, после чего ее центрифугируют (1000 об./мин). Надосадочную жидкость удаляют, а к эритроцитам в осадке добавляют 0,4-0,6 мл забуференного физиологического раствора и используют для заражения куриных эмбрионов (по 0,1 мл).
Подготовленные к вирусовыделению образцы должны сохраняться при температуре 4°С не дольше 48 ч. При необходимости более продолжительного хранения их разливают в ампулы, которые погружают в смесь сухого льда со спиртом, или сохраняют в морозильной камере при -70°С, или в жидком азоте.
В случаях, когда материалом для выделения вируса гриппа является кровь или спинномозговая жидкость, в которых он может находиться в составе иммунного комплекса, исследуемый материал обрабатывают антииммуноглобулиновой сывороткой.
^ Выделение вируса гриппа на куриных эмбрионах
Этот метод диагностики гриппа является наиболее доступным и чувствительным. Используют 9-11-дневные куриные эмбрионы, которые заражают инфекционным материалом в объеме 0,1 мл в амниотическую и аллантоисную полости, после чего эмбрионы инкубируют при температуре 33-34°С 72 ч.
При выделении вируса гриппа С материал инокулируют только в амниотическую полость 7 дневных куриных эмбрионов и инкубируют при температуре 33°С 5 сут.
После соответствующей инкубации эмбрионы охлаждают на протяжении 16-18 ч при 4°С и осуществляют их вскрытие. Далее отбирают эмбриональные жидкости - амниотическую и аллантоисную, в которых проводят индикацию вируса гриппа. Для этого используют реакцию гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами морской свинки, петуха или человека с группой крови 0. Доказано, что эритроциты млекопитающих более чувствительны, чем куриные, для индикации вируса в эмбриональных жидкостях на ранних пассажах. Когда вирус уже адаптирован к куриным эмбрионам для индикации целесообразно использовать эритроциты петуха, которые больше по размерам и быстрее оседают.
Если результат РГА отрицательный, проводят два-три дополнительных слепых пассажа, после чего (при сохранении результата РГА) исследование материала прекращают, а образец считают несодержащим вирус гриппа.
В случае наличия агглютинации эритроцитов собранную эмбриональную жидкость освещают центрифугированием в течение 10 мин при скорости 10 тыс. об./мин и хранят при 4°С. При необходимости дополнительного культивирования выделенного вируса эмбриональную жидкость разводят раствором Хенкса или забуференным физиологическим раствором до концентрации 10-100/ГАЕ мл и используют для последующего заражения куриных эмбрионов.
При положительной РГА проводят титрование изолята в этой же реакции. Для этого изолят последовательно разводят с кратностью 2 в двух параллельных рядах лунок планшета для иммунологических исследований от 1:2 до 1:1280 в объеме 0,2 мл. При каждом разведении в каждую лунку добавляют по 0,2 мл физиологического раствора натрия хлорида и по 0,4 мл 1% взвеси эритроцитов петуха. Через 20-30 мин учитывают результат титрования вируса в РГА. Различие титра в двух рядах может не превышать одно-двукратного разведения. Если разница больше, титрование следует повторить. Вычисляя титр (в случае двукратного различия), высчитывают его среднеарифметическое значение.
Если титр в РГА 1:8 или больше, вирус идентифицируют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Если он меньше чем 1:8, его стараются повысить.
Существует несколько методов повышения гемагглютинирующей активности свежевыделенных штаммов вируса гриппа. Чаще всего это - проведение дополнительных пассажей на куриных эмбрионах методом пограничных разведений. Успешно используют и ультразвук, разрушающий ингибиторы, блокирующие гемагглютинины вируса. После 5-7-минутной обработки ультразвуком гемагглютинирующая активность вируса возрастает в 4-16 раз, что ускоряет возможность идентификации выделенных вирусов в РТГА.
После определения достаточного гемагглютинирующего титра изолированного вируса гриппа, его идентифицируют в РТГА. Для этого готовят рабочее разведение вируса, который содержит 4 ГАЕ в заданном объеме жидкости (если титровали в объеме 0,2 мл, то в 0,2 мл). Контролируют правильность приготовления рабочего разведения и, если необходимо, корригируют его. После такой коррекции необходимо снова проверить правильность рабочей дозы возбудителя. Далее осуществляют постановку РТГА: к последовательным разведениям коммерческих диагностических сывороток против возбудителей гриппа А (Н1N1), A (H2N2), A (H3N2), В и С до определенного в инструкции титра добавляют равный объем рабочего разведения выделенного вируса в каждую лунку каждой сыворотки. После определенной экспозиции (чаще 1 ч при комнатной температуре) в каждую лунку вносят двойной объем эритроцитов петуха и через 30 мин определяют результат.
В случае использования для идентификации вируса гриппа в РТГА диагностических иммунных сывороток, относительно которых не указано, что они получены к ингибиторрезистентным штаммам вируса гриппа, их освобождают от неспецифичных ингибиторов гемагглютинации вируса или для контроля берут неиммунную сыворотку крови от животного одного и того же вида, при иммунизации которого получена диагностическая сыворотка. Если такая контрольная сыворотка тормозит гемагглютинацию вируса в титре 1:20-1:40, то идентификацию вируса следует проводить только после устранения ингибиторов.
В тех случаях, когда для идентификации вирусов гриппа используются диагностические сыворотки, полученные к ингибиторрезистентным штаммам, дополнительная обработка их не нужна.
Таксономическая характеристика выделенного вируса гриппа определяется в РТГА по той диагностической сыворотке, которая тормозит его гемагглютинацию. После идентификации вируса вирусологическое исследование считается законченным.
Если выделенный вирус значительно отличается в титрах РТГА от эталонного штамма (к которому получена диагностическая сыворотка, и титр которого указан на этикетке) или идентификация его в РТГА оказывается неудачной, тип вируса можно определить в реакции связывания комплемента (РСК).
В РСК используют гемолитическую сыворотку в трехкратном титре, две дозы предварительно оттитрованного комплемента и аллантоисный антиген в количестве 12-16 ГАЕ (по РГА). Разводить антиген ФБР (рН 7,0-7,2) выше, чем 1:10 не рекомендуется.
Использование в РСК иммунных сывороток морской свинки и аллантоисного антигена не нуждается в титровании комплемента в их присутствии, поскольку они не обладают антикомплементарными свойствами.
^ Выделение вирусов гриппа в культурах клеток
Использование культур клеток для выделения вируса гриппа определяется возможностями лаборатории. Наиболее чувствительными для выделения вирусов гриппа являются однослойные первично трипсинизированные культуры из почек обезьян, эмбриона человека, однодневных цыплят. Но следует иметь в виду, что в этих культурах клеток размножается также и большинство других респираторных вирусов, что обусловливает необходимость дифференциации всей группы возбудителей острых респираторных вирусных инфекций.
Для выделения вирусов гриппа могут быть использованы и перепривитые культуры клеток, причем цитопатический эффект наиболее четко выражен на культурах MDCK и LLC-MK-2.
Цитопатическое действие вируса гриппа характеризуется круглоклеточной дегенерацией монослоя. Цитопатические признаки в зараженной культуре иногда появляются на 3-й день, а иногда и позже, вплоть до 10-го дня с момента заражения. Вирусы гриппа А репродуцируются медленнее, их цитопатическое действие определяется появлением фестончатых или вакуолизирующих клеток, отшелушивающихся в процессе дегенерации. Обнаружить такие клетки тяжело, иногда это возможно лишь на втором пассаже. Индикация вируса в клетках по гемадсорбции является более целесообразной, поскольку последняя проявляется значительно раньше, чем цитопатические изменения.
В реакции гемадсорбции (РГадс) чаще применяют эритроциты морской свинки. При постановке РГадс в каждую пробирку с культурой клеток (зараженной и контрольной) после удаления культуральной среды добавляют по 0,1 мл раствора Хенкса и 0,2 мл 0,4% суспензии эритроцитов морской свинки. Пробирки оставляют клетками вниз на 10 мин при комнатной температуре и микроскопируют. При наличии гемадсорбции в поле зрения микроскопа оказываются клетки, плотно покрытые прикрепленными эритроцитами, не смывающимися при встряхивании. Результат считают положительным при отсутствии гемадсорбции в контрольных пробирках с незараженными клетками. При отрицательной
Выделение вируса гриппа из клинического материала подтверждает диагноз гриппа. Но отрицательный результат вирусовыделения не свидетельствует об отсутствии вируса гриппа у пациента с респираторной инфекцией гемадсорбции пробирки встряхивают и вторично регистрируют результат через 10 мин. Если при повторной проверке реакция отрицательная, эти пробы подлежат следующему пассажу.
Индикацию присутствия вируса в зараженной культуре клеток осуществляют и в РГА культуральной жидкости. Если титр гемагглютининов в последней составляет 1:8 и выше, выделенные вирусы гриппа идентифицируют в РТГА. Если титр 1:4 и меньше, материал дополнительно культивируют для повышения титра или проводят первичную идентификацию в РГ^ на инфицированной культуре. Для специфического торможения гемадсорбции выделенного вируса титр диагностической иммунной сыворотки может составлять не менее 1:160 и, безусловно, антигемагглютинины сыворотки должны отвечать антигенной структуре выделенного вируса. Недостатком реакции является то, что в указанных условиях она проводится с неизвестной дозой вируса, что снижает ее чувствительность.
РГадс может быть использована для исследований во время вспышек гриппа с уже определенной этиологией, когда нужно лишь подтвердить известный тип вируса, или в тех случаях, когда нельзя получить достаточный титр гемагглютининов.
Перед постановкой РГадс иммунные сыворотки предварительно обрабатывают адсорбцией на эритроцитах морской свинки. Исследуемые и контрольные культуры клеток дважды промывают раствором Хенкса, потом в каждую пробирку вливают по 0,2 мл сыворотки, разбавленной 1:10, и добавляют 0,6 мл указанного раствора. Культуру выдерживают 30 мин при комнатной температуре и подвергают испытанию на наличие гемадсорбционных свойств с эритроцитами морской свинки (0,4% суспензия). Штамм вируса идентифицируют по сыворотке, вызвавшей торможение гемадсорбции.
Выделение вируса гриппа из клинического материала подтверждает диагноз гриппа. Но отрицательный результат вирусовыделения не свидетельствует об отсутствии вируса гриппа у пациента с респираторной инфекцией.
В вирусологической лаборатории можно осуществлять и другие вирусологические исследования, например, определение резистентности вируса гриппа к одному из специфических противогриппозных препаратов, инфекционной активности живых противогриппозных вакцин и т. п.
^ Серологическая диагностика
Серологическая диагностика гриппа базируется на выявлении возрастания титра противогриппозных антител в динамике заболевания или на определении специфических иммуноглобулинов класса М.
Для данного вида диагностики гриппа чаще применяют РТГА. Последнюю выполняют микрометодом с использованием микропланшетов для иммунологических исследований (общий объем реакции -100 мкл).
В процессе серологического исследования сывороток крови в РТГА используют их последовательные (начиная с 1:10) двукратные разведения на изотоническом растворе натрия хлорида, диагностикумы вирусов гриппа А(Н1N1), A(H3N2) и В в рабочем разведении 4 ГАЕ в 25 мкл, а также взвесь эритроцитов петуха или человека с группой крови 0 в концентрации 0,4-0,5% (соотношение объемов перечисленных компонентов РТГА 1:1:2).
Перед исследованием сыворотки крови обрабатывают с целью освобождения их от неспецифических ингибиторов гемагглютинации вирусов гриппа. Для этого чаще используют универсальный препарат - рецепторразрушающий энзим (РРЭ), подходящий для устранения неспецифической ингибиции гемагглютинации вирусов гриппа всех типов. РРЗ представляет собой фермент нейраминидазу, получаемую из нехолерных вибрионов.
Термолабильные мукополисахаридные ингибиторы разрушают прогреванием сывороток при температуре 56°С на протяжении 30 мин. Для освобождения от термостабильных ингибиторов можно использовать риванол (этакридина лактат), двуокись углерода и т. п. Однако эти методы по эффетивности значительно уступают методу обработки РРЭ, поскольку могут частично разрушать и антитела.
Для серодиагностики гриппа можно исследовать и одну только сыворотку крови больного на наличие противогриппозных иммуноглобулинов класса М, которые свидетельствуют об острой инфекции. При отдельном определении антител класса М сыворотку крови больного предварительно разделяют на 2 порции, одну из которых сохраняют до постановки определенной серологической реакции, а другую обрабатывают для разрушения макроглобулинов класса М физическими или химическими методами. Один из них - прогревание порции сыворотки при 60 °С на протяжении 30 мин, второй - обработка порции сыворотки 2-меркаптоэтанолом. После этого обе порции исследуют, например, в РТГА. Снижение титров противогриппозного антигемагглютинина в 4 и более раз в порции сыворотки, в которой предварительно разрушали иммуноглобулин, свидетельствует об их наличии в исследуемой сыворотке, что лабораторно подтверждает диагноз гриппа.
Существует методика выборочного удаления из одной порции исследуемой сыворотки противогриппозных lg с помощью белка А золотистого стафилококка (штамма Cowan). При последующем серологическом исследовании обеих порций сыворотки выявление сниженного или неизмененного титра специфических антител в обработанной порции свидетельствует о наличии в ней иммуноглобулина, Отсутствие антител в обработанной порции сыворотки (при их наличии в необработанной) позволяет сделать вывод, что выявленные антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов, а респираторное заболевание вызвано не вирусом гриппа.