Результаты реакции агглютинации

	Разведения сыворотки
Контроль	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600
Степень агглютинации

Вывод____________

2. а) Прямой иммунофлуоресцентный метод.

Приготовить на предметном стекле из исследуемой культуры бактерий тонкий мазок (в густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток). Границы мазка отметить с тыльной стороны восковым карандашом. Подсушить препарат на воздухе и погрузить его в стакан­чик с 96° этиловым спиртом для фиксирования на 15 минут, а затем вновь подсушить на воздухе. После этого нанести на мазок каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении. (Рабочее разведение сухих люминесцирующих сывороток указано на этикетке ампулы). Препарат обрабатывается сывороткой в течение 15-20 минут при комнатной температуре. По окончании окраски каплю сыворотки стряхивают, а препарат промывают в течение 10 минут проточной водопроводной во­дой, затем подсушивают на воздухе и наносят на него каплю разведенного глицерина (9 частей глицерина +1 часть физиологического раст­вора). Накрывают препарат покровным стеклом, избыток жидкости уда­ляют фильтровальной бумагой.

Микроскопию производят в люминесцентном микроскопе. При этом используют специальное нефлуоресцирующее иммерсионное масло.

При наличии в исследуемом материале бактерий, по отношению к которым люминесцирующая сыворотка содержит антитела, на темном фоне препарата обнаруживается специфическое яркое желто-зеленое свечение по периферии бактериальных клеток. Посторонние бактерии не светятся.

Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему:

++++ сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета с четко выраженной формой клеток;

+++ яркая флуоресценция желто-зеленого цвета;

++ и + заметная, но слабо выраженная флуоресценция.

Положительным результатом считается флуоресценция, оценивае­мая

на ++++ и +++.

Иммунофлуоресцентный метод является методом ускоренной ориентировочной диагностики и должен сопровождаться полным бактериологическим исследованием.

б) Непрямой иммунофлуоресцентный метод предусматривает использование единой флуоресцирующей сыворотки - антиглобулиновой, содержащей антитела против кроличьих глобулинов. Как правило, диагностические специфические сыворотки являются кроличьими, поэтому флуоресцирующая антиглобулиновая сыворотка реагирует с любыми специфическими антителами (кроличьими глобулинами), которые при этом играют роль антигенов. Кроличьи глобулины (специфические антитела) связываются с гомологичными антигенами. На образовавшихся комплексах фиксируются флуоресцирующие антиглобулиновые антитела и вызывают их свечение в люминесцентном микроскопе.

3. В основе методов иммуносорбентного анализа твердой фазы лежит сорбция антител (для обнаружения неизвестного антигена) или антигена (для обнаружения соответствующих антител) и специфических антител, меченных ферментом (ИФМ) или изотопом (РИМ). Чувствительность этих методов значительно превышает чувствительность обычных иммунологических реакций, поэтому они приобрели самое широкое рас­пространение. Практически эти методы могут быть использованы для диагностики любого инфекционного заболевания. С помощью этих методов можно определять как антигены, так и антитела к ним. Методика постановки этих реакций включает три последовательных этапа.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.

Первый этап - адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхности лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связываются со стенками лунок, но у них сох­раняются свободными активные центры, и они способны поэтому специ­фически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап - связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело-антиген, происходящей на границе твердая фаза - жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело - антиген специфическими антителами против дан­ного антигена, но меченными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к антигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в иссле­дуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фазы формируется комплекс: антитело-антиген - меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антитела метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит ортофенилендиамин (ОФД) в смеси с Н₂0₂, используемый в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку раствора ОФД приводит к тому, что он подвергается действию персокидазы, фиксированной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интенсивность которой позволяет количественно оценивать результаты опыта фотометрированием.

Радиоиммуный метод (РИМ) предусматривает использование антител, меченных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоактивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактивности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицатель­ных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител эти реакции также ставятся в три этапа.

Первый этап - адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т.е. на их стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап - добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в них специфических антител к данному анти­гену. Если они имеются, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген-антитело.

Третий этап - после отмывания луночек в них добавляют специфические антиглобулиновые антитела (антивидовые, т.е. антитела про­тив человеческих иммуноглобулинов, но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оцениваются как указано выше. В качестве контролей используют образцы, заведомо положительные и заведомо отрицательные.

4. Моноклональные антитела - антитела, продуцируемые одним клоном антителообразующих клеток. По всем параметрам антитела, вырабатываемые одним клоном, идентичны (по классу иммуноглобулинов; по их типу и антительной специфичности). Они взаимодействуют только с одним антигеном, и это обстоятельство значительно повышает специфичность всех иммунологических реакций, в которых они участвуют. Получение моноклональных антител стало возможным после того, как в 1975 году Кёллером и Мильштейном была разработана методика получения клеточных гибридов -гибридом путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с культивируемыми в питательной среде клетками миеломных штаммов. Были использованы такие штаммы, которые не содержали фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (поэтому они погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин - ГАТ).

Лимфоциты в такой среде не гибнут. Слияние лимфоцитов с миеломными клетками осуществляется с помощью полиэтиленгликоля. Слившиеся гибридомные клетки получают от лимфоцита способность синтезировать определенные антитела (моноклональные антитела, т.е. анти­тела одной специфичности) и способность выживания в среде с ГАТ. От миеломного партнера они получают способность размножаться бесконеч­но in vitro.

Накопившийся гибридомный клон может быть размножен, а синтези­руемые им моноклональные антитела могут быть получены в неограниченном количестве.

Уже созданы фирмы по выработке моноклональных антител любой специфичности в качестве уникальных реагентов, диагностических и лечебных препаратов.

Получение лимфоцитарных гибридом включает в себя несколько эта­пов:

1. Получение миеломкой линии.

2. Получение селезеночных клеток от иммунизированного организма.

3. Создание в культуре условий для того, чтобы хотя бы некоторые клетки одной и другой популяции могли осуществить слияние.

4. Выделение слившихся клеток и накопление их клонов.

5. Отбор заданного клона, его накопление и использование. Накопление клона осуществляется in vitro или путем введения животным.

При этом на всех этапах образующиеся клетки необходимо консер­вировать в жидком азоте, чтобы в любое время можно было вернуться к любому этапу и сохранить на будущее нужные клоны.

В качестве миеломных клеток чаще всего используются мышиные или крысиные клеточные линии. Гибридомы создают не только на основе В - лимфоцитов, обеспечивающих возникновение культур, синтезирующих моноклональные антитела, но и на основе Т - лимфоцитов. Уже сконструированы культуры Т - гибридом, синтезирующие лимфокины.

Контрольные вопросы

На чем основаны методы иммуносорбентного анализа твердой фазы?

С какой целью используются иммуноферментные методы?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антитела в иссле­дуемой сыворотке?

Каким образом с помощью ИФМ можно обнаружить антиген в иссле­дуемом материале?

Как ставится реакция латекс-агглютинации и как она оценивается?

Что такое моноклональные антитела и каковы их преимущества перед обычными иммунными сыворотками?

Как получают моноклональные антитела?

Из каких основных этапов складывается постановка реакций иммуноферментного метода и радиоиммунного метода?

Что такое гибридомы и как их получают? Какие клетки скрещивают­ся для получения гибридом?

Какая разница между антигенным и антительным эритроцитарным диагноетикумом?

Каковы преимущества и недостатки иммунофлуоресцентного метода?

Почему препараты-мазки при этом методе исследования не должны быть слишком густые?

В чем состоит сущность иммунофлуоресцентного метода исследования?

Каково различие между прямым и непрямым методами иммунофлуоресцентного исследования?

З А Н Я Т И Е18

Дата ______________

Тема: Итоговое контрольное занятие «Инфекция и иммунитет».

Вопросы к итоговому занятию «Инфекция и иммунитет»

1. Патогенность микроорганизмов. Определение понятия. Вирулентность, единицы ее измерения.

2. Иммунитет, определение понятия, классификация иммунитета.

3. Реакция связывания комплемента (РСК), техника постановки, учет результатов.

4. Основные группы факторов патогенности бактерий.

5. Главная система гистосовместимости человека (МНС), ее основные локусы и функции.

6. Реакция иммунофлуоресценции прямая и непрямая, цели использования, учет результатов.

7. Экзотоксины бактерий, их отличительные свойства.

8. Что такое гаптены, полугаптены, шлеппер, детерминантная группа (эпитоп)?

9. Что собой представляет реакция агглютинации и каково ее практическое использование?

10. Эндотоксины бактерий, их отличительные свойства.

11. Какие центральные и периферические органы иммунной системы Вы знаете?

12. Сущность реакции преципитации, методические варианты ее постановки.

13. Анатоксины, получение, практическое использование.

14. Что такое антигены, их основные свойства? Что такое «полноценный антиген» и «неполноценный антиген»?

15. В чем состоит сущность радиоиммунного метода диагностики (РИМ или РИА) инфекционных заболеваний?

16. Факторы адгезии и колонизации бактерий, их природа и значение.

17. Что такое «антитела»? Молекулярная структура иммуноглобулина класса G (IgG), цепи, фрагменты.

18. В чем состоит сущность иммуноферментного метода диагностики (ИФМ, ИФА, РЭМА) инфекционных заболеваний?

19. Анатомо-физиологические механизмы естественной резистентности.

20. Каким образом Т-хелперы управляют дифференцировкой и скоростью размножения В-лимфоцитов?

21. Развернутая реакция агглютинации, техника постановки. Понятие о титре агглютинирующий сыворотки.

22. Состав нормальной микрофлоры толстого кишечника человека. Почему она является мощным фактором естественной резистентности?

23. Чем отличается первичный иммунный ответ от вторичного?

24. Что собой представляет реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) и для каких целей она применяется?

25. Какие ферменты «защиты и агрессии» бактерий Вы знаете? Методы их обнаружения у бактерий?

26. Понятие о системе мононуклеарных фагоцитов. Функции макрофагов.

27. Какие варианты реакции агглютинации применяются в качестве экспресс-методов для диагностики инфекционных заболеваний?

28. Что такое «факторы инвазии»? Чем они могут быть представлены?

29. Формы иммунного ответа. Что такое «иммунологическая толерантность» и чем она обусловлена?

30. Классификация диагностических серологических реакций по технике постановки и механизму протекания.

31. Какие факторы патогенности являются «препятствующими фагоцитозу» и какие «подавляющими фагоцитоз»?

32. Формы иммунного ответа. Иммунологическая память, ее природа.

33. Понятие об иммунных сыворотках, их классификация, получение, титрование, практическое использование.

34. Методы определения токсигенности бактерий.

35. Формы иммунного ответа. Гиперчувствительность немедленного типа, механизм ее развития, клинические проявления.

36. Вакцины. Определение понятия, классификация, получение, использование.

37. Комплемент. Состав и основные функции.

38. Как осуществляется процессинг антигена и его презентация иммунокомпетентным клеткам?

39. Реакция Кумбса, сущность, преимущества перед другими серологическими реакциями.

40. Пути активации системы комплемента.

41. Антигены микробной клетки. Для чего необходимо знать антигенное строение микробной клетки?

42. Что такое «моноклональные» антитела? Какими свойствами они обладают и как их получают?

43. Что такое фагоцитоз? Его механизм и стадии. Понятие о завершенном и незавершенном фагоцитозе.

44. Что такое трансплантационный иммунитет и какими клетками иммунной системы он опосредуется?

45. Иммуносорбентные реакции, механизм их протекания.

46. Субпопуляции Т- и В-лимфоцитов, их основные функции.

47. Формы иммунного ответа. Отличительные особенности и природа гиперчувствительности замедленного типа.

48. Динамика развития инфекционного процесса. Причины хронизации инфекционного заболевания и формирования носительства.

49. Что такое инфекция? Ее основные формы.

50. Формы иммунного ответа. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия, сущность и значение.

51. Значение серологического и аллергического методов в диагностике инфекционных заболеваний.

52. Источники инфекции. Классификации инфекций по источнику и этиологии. Пути и способы заражения человека.

53. Классы иммуноглобулинов. Их основные отличия, участие в различных иммунных реакциях in vivo и in vitro.

54. Что такое лимфокины? Какие функции они выполняют?

[1]*Под физиологическим раствором здесь и далее следует понимать 0,85%-ный раствор NaСl.