Определение осмотической устойчивости эритроцитов

Основано на оценке степени гемолиза в гипотонических растворах хлорида натрия, в которых происходит набухание и гемолиз эритроцитов. Выделяют 2 вида осмотической устойчивости эритроцитов: максимальная 0,28-0,32 % NaCl (разрушаются молодые эритроциты); минимальная0,44-0,48 % NaCl (разрушаются старые эритроциты). Если границы сдвигаются в сторону максимальной устойчивости, то в периферической крови преобладают молодые эритроциты; если к минимальной устойчивости, то старые (кроветворение ослаблено).

ЦЕЛЬ: освоить методику определения осмотической устойчивости эритроцитов.

ОСНАЩЕНИЕ: дефибринированная кровь, штатив для пробирок, 10 пробирок, восковой карандаш, пипетка, стеклянная палочка, растворы хлорида натрия убывающей концентрации.

ХОД РАБОТЫ: предварительно готовят рабочие растворы натрия хлорида различной концентрации от 0,15 до 0,6%. Рабочие растворы натрия хлорида разливают по 5 мл в 10 центрифужных пробирок. В каждую добавляют по 3-5 капель дефибринированной крови. Пробирки оставляют на 1 час при комнатной температуре, а затем центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость из каждой пробирки исследуют на фотоэлектроколориметре. Определяют процент (степень) гемолиза, приняв за 100% гемолиз в пробирке с 0,15% раствором натрия хлорида. Гемолиз можно определять и визуально по цвету надосадочной жидкости. При его отсутствии наблюдается бесцветный раствор и большое количество осадка. При частичном гемолизе - появление окраски надосадочной жидкости (розовение) и уменьшение осадка. При полном гемолизе эритроцитов - интенсивная красно-лаковая окраска надосадочной жидкости и отсутствие осадка.

Частичный гемолиз характеризуется окрашиванием раствора и появлением осадка неразрушенных эритроцитов. Начало гемолиза (минимальная его степень) определяется по легкому порозовению (при визуальном определении гемолиза количество рабочего раствора в пробирке должно быть меньше 1,0 мл). Бесцветный раствор и большое количество осадка свидетельствуют об отсутствии гемолиза.

Определить, при какой концентрации раствора хлорида натрия наступает гемолиз и сделать вывод об осмотической устойчивости исследованных эритроцитов.

Е практическое занятие. Форменные элементы крови.

Физиологическая характеристика эритроцитов. Понятие об эритроцитозе и эритропении, анизоцитоз, пойкилоцитоз.

Гемоглобин, его виды и соединения, возрастные изменения, физиологическое значение. Цветовой показатель.

Физиологическая характеристика лейкоцитов. Лейкоцитарная формула и её клиническое значение. Понятие о лейкоцитозе и лейкопении. Изменение картины периферической крови при физических нагрузках.

Кроветворение, регуляция.

Методы подсчёта форменных элементов в камере Горяева.

Вопросы программированного контроля по теме занятия.

1. Сколько эритроцитов в одном литре крови: у мужчин, у женщин?

2. Какие функции выполняют эритроциты, что для них характерно?

3. Что такое эритроцитоз, эритропения?

4. Что характеризует кривая Прайс-Джонса? Что такое микроцитоз, макроцитоз,

анизоцитоз, пойкилоцитоз?

5. Какие методы используются для определения количества эритроцитов?

6. Какие из указанных величин соответствуют содержанию гемоглобина в крови женщин,

мужчин?

7. Что характерно для гемоглобина плода, новорожденного, взрослого?

8. Соединения гемоглобина.

9. Чему равен цветной показатель и о чём он говорит? Как определяется?

10. Какие функции выполняют лейкоциты? Сколько их в одном литре крови?

11. Что такое лейкоцитоз и лейкопения? Причины их вызывающие?

12. Какие лейкоциты относятся к гранулоцитам и к агранулоцитам?

13. Каковы функции базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов?

Каково их % содержание?

14. Как определяется лейкоцитарная формула? Причины её сдвига вправо, влево?

15. В каких случаях будет меняться соотношение зрелых и молодых нейтрофилов?

16. Что характерно для процесса кроветворения (гемопоэза), в каких органах он

протекает? Что характерно для костного мозга, его функции?

17. Какие факторы поддерживают эритроцитарное равновесие в организме?

18. Каковы свойства стволовой полипотентной клетки, частично детерминированной

клетки, унипотентной клетки?

19. Какие функции выполняет микрососудистый компонент короткоранговой регуляции

кроветворения?

20. Какие факторы могут принимать участие в специфической дальноранговой регуляции

гемопоэза?

21. Какие факторы участвуют в неспецифической регуляции гемопоэза?

Практические работы.

Счётная камера Горяева представляет собой толстую стеклянную пластину (предметное стекло) с углублением в центре, равным 1/10 мм. На дне камеры нанесены две сетки Горяева, разграниченные глубокой поперечной канавкой. Сбоку от сеток находятся стеклянные прямоугольные пластинки, к которым притирают специальные шлифовальные покровные стекла. Сетка Горяева представляет собой квадрат 3 х 3 мм, который разделен сверху и слева на 15 равных частей и состоит из 225 больших квадратов. Каждый третий ряд как сверху, так и слева разделен еще на 4 части и таким образом на пересечении образуются квадраты, разделенные на 16 малых. Большие квадраты, рассеченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов чередуются с квадратами, разделенными только вертикальными или горизонтальными линиями; и квадратами чистыми, без линий.

Счётная камера Горяева. Меланжеры.

а) – вид сверху; б) – вид сбоку; а – для эритроцитов

в) – сетка Горяева. б – для лейкоцитов

Сторона большого квадрата 1/5 мм; площадь большого квадрата 1/25 мм²; глубина камеры равна 1/10 мм; объем большого квадрата 1/250 мм³.

Сторона малого квадрата 1/20 мм; площадь малого квадрата 1/400 мм²; глубина камеры равна 1/10 мм; объем малого квадрата 1/4000 мм³.

Для исключения ошибок подсчёта форменных элементов, связанных с их нахождением на границах квадратов, применяют правило Егорова:клетки считают внутри квадрата и на его верхней и левой границах.

1. Подсчёт эритроцитов в камере Горяева.

Камера Горяева должна быть сухой и чистой. К ней притирают покровное стекло до появления радужных полос (только при этих условиях соблюдается правильный объем камеры). Смеситель (меланжер) также должен быть чистым и обязательно сухим, на его короткий капилляр надевают резиновую трубку с грушей. В меланжер для эритроцитов (красная палочка в шарообразном расширении) до нижней метки "0,5" набирают кровь, погрузив в нее кончик смесителя; затем до метки "101" за шарообразным расширением 3% гипертонический раствор, в котором эритроциты сморщиваются - кровь разводится в 200 раз. Кровь набирают строго до метки, но если получилось больше, необходимо выпустить на ватку или фильтровальную бумагу. Закончив набор жидкости, переведите смеситель (меланжер) в горизонтальное положение, снимите резиновую трубку, закройте капилляр с обеих сторон большим и указательным пальцами и тщательно перемешайте кровь с жидкостью в расширении смесителя, встряхивая его. Кровь готова для подсчета эритроцитов. Полученной смесью заполняют счетную камеру Горяева. После заполнения камеры оставьте на 1-2 минуты в покое для оседания форменных элементов, приступайте к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (диафрагма прикрыта и несколько опущен конденсор). Эритроциты считают в 5 больших (5 * 16 = 80 малых) квадратах. Подсчёт производят по формуле: Э = А*4000*200*10^⁶/80

где Э - количество эритроцитов в 1 л крови; А - сумма эритроцитов в 5-ти больших квадратах (80-ти малых); 4000 - множитель, приводящий к объёму крови 1 мкл (объём малого квадрата 1/4000 мкл); 200 - разведение крови (кровь в меланжере разводится в 200 раз); 80 - число малых квадратов; 10^⁶ - количество мкл в одном литре. Количество эритроцитов в норме:у женщин 3,9-4,7 10^¹² /л; у мужчин 4-5 10^¹² /л.

Произведите подсчёт количества эритроцитов в 1 л крови, сделайте заключение о соответствии полученных результатов нормативным.