Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.
Микробиология. Лабораторный практикум
Волгоград 2012
Введение
Микробиология(от греч. micros - малый, bios - жизнь, logos - учение) - наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов мельчайших форм жизни растительного или животного происхождения, не видимых невооруженным глазом.
Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы). По своей сути микробиология является биологической фундаментальной наукой. Для изучения микроорганизмов она использует методы других наук, прежде всего физики, биологии, биоорганической химии, молекулярной биологии, генетики, цитологии, иммунологии. Как и всякая наука, микробиология подразделяется на общую и частную. Общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на всех уровнях: молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Предметом изучения частной микробиологии являются отдельные представители микромира в зависимости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую природу, в том числе человека. К частным разделам микробиологии относятся: медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская, космическая микробиология.
Медицинская микробиология изучает патогенные для человека микроорганизмы: бактерии, вирусы, грибы, простейшие. В зависимости от природы изучаемых патогенных микроорганизмов медицинская микробиология делится на бактериологию, вирусологию, микологию, протозоологию.
Каждая из этих дисциплин рассматривает следующие вопросы:
морфологию и физиологию, т.е. осуществляет микроскопические и другие виды исследований, изучает обмен веществ, питание, дыхание, условия роста и размножения, генетические особенности патогенных микроорганизмов;
роль микроорганизмов в этиологии и патогенезе инфекционных болезней;
основные клинические проявления и распространенность вызываемых заболеваний;
специфическую диагностику, профилактику и лечение инфекционных болезней;
экологию патогенных микроорганизмов.
К разделам микробиологии относят также санитарную и клиническую микробиологию.
Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды, взаимоотношение микрофлоры с организмом, влияние микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности на состояние здоровья человека, разрабатывает мероприятия, предупреждающие неблагоприятное воздействие микроорганизмов на человека. В центре внимания клинической микробиологии. Роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, диагностика и профилактика этих болезней.
Фармацевтическая микробиология исследует инфекционные болезни лекарственных растений, порчу лекарственных растений и сырья под действием микроорганизмов, обсемененность лекарственных средств в процессе приготовления, а также готовых лекарственных форм, методы асептики и антисептики, дезинфекции при производстве лекарственных препаратов, технологию получения микробиологических и иммунологических диагностических, профилактических и лечебных препаратов.
Ветеринарная микробиология изучает те же вопросы, что и медицинская микробиология, но применительно к микроорганизмам, вызывающим болезни животных.
Микрофлора почвы, растительного мира, влияние ее на плодородие, состав почвы, инфекционные заболевания растений и т.д. находятся в центре внимания сельскохозяйственной микробиологии.
Морская и космическая микробиология изучает соответственно микрофлору морей и водоемов и космического пространства и других планет.
Техническая микробиология, являющаяся частью биотехнологии, разрабатывает технологию получения из микроорганизмов разнообразных продуктов для народного хозяйства и медицины (антибиотики, вакцины, ферменты, белки, витамины). Основа современной биотехнологии - генетическая инженерия.
Многочисленные открытия в области микробиологии, изучение взаимоотношений между макро- и микроорганизмами во второй половине XIX в. способствовали началу бурного развития иммунологии. Вначале иммунология рассматривалась как наука о невосприимчивости организма к инфекционным болезням. В настоящее время она стала общемедицинской и общебиологической наукой. Доказано, что иммунная система служит для защиты организма не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных организму веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды организма, т.е. гомеостаза.
Иммунологияявляется основой для разработки лабораторных методов диагностики, профилактики и лечения инфекционных и многих неинфекционных болезней, а также разработки иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов, иммуномодуляторов, аллергенов, диагностических препаратов). Разработкой и производством иммунобиологических препаратов занимается иммунобиотехнология самостоятельный раздел иммунологии.
Современная медицинская микробиология и иммунология достигли больших успехов и играют огромную роль в диагностике, профилактике и лечении инфекционных и многих неинфекционных болезней, связанных с нарушением иммунной системы (онкологические, аутоиммунные болезни, трансплантация органов и тканей и др.).
Тема №1. «Микробиологическая лаборатория, ее задачи. Техника безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа и техника микрокопирования. Основные формы бактерий, определение их величины»
Цель занятия: Изучить микробиологическую лабораторию. Технику безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа.
Материалы и оборудование:
Ветеринарные лаборатории – это учреждения государственной ветеринарной службы, деятельность которых направлена на обеспечение благополучия в животноводстве, предупреждение и ликвидацию болезней и гибели животных, а также на охрану населения от болезней, общих для человека и животных (зооантропонозов). По значению бывают: районные, межрайонные (зональные), областные (краевые) и республиканские.
Основная задача ветеринарных лабораторий – установление точного диагноза болезней сельскохозяйственных животных, включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел, а также экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов животного и растительного происхождения. Также выполняются научно – исследовательские работы, осуществляют производство некоторых антибиотиков, биостимуляторов.
Лаборатория занимает отдельное здание, расположенное вдали от проезжих дорог. В ней должно быть приемное отделение, патологоанатомический, биохимический и вирусологический отделы, спец помещения для термостатов, мытья посуды, автоклавная.
В лаборатории столы для работы расположены у окна так, чтобы было максимум света и удобств. При небольшом количестве окон в лаборатории для занятий можно использовать столы трапециевидной формы, такие столы ставят перпендикулярно к окну, края столов должны быть скошены под углом 70-80°, это позволяет сидящим дальше от окна беспрепятственно пользоваться светом.
Столы покрываются пластиком, толстым стеклом. Вдоль стола, посередине ставят штативы для пробирок, флаконы, капельницы с красителями в штативах, колодках, спиртовки или горелки. По этому же ряду монтируют освещение, которое должно быть приближено к естественному. Для занятий по проведению биологических исследований, вскрытию органов желательно иметь дополнительный небольшой стол. Для полного обеспечения учебного процесса в лаборатории должны быть культуры микроорганизмов, аппаратура и подсобные помещения:
Моечная
Должны иметься столы, раковины, электрические и газовые плиты, сушильные и вытяжные шкафы, которые необходимы для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены должны быть облицованы плиткой.
Стерилизационная
Оборудована 1 или 2 стерилизаторами паровых, столом, при наличии 2-х паровых стерилизаторов занятия в нескольких подгруппах можно проводить без длительного перерыва, а во время повреждения одного из них, пользуются другим.
Здесь должна быть хорошая вентиляция для удаления остатка пара, выходящего после открывания стерилизатора. Пар из стерилизатора выводят через резиновую трубку во внешнюю среду или направляют в ведро с водой. Дверь неостекленная, окна открываются наружу.
Средоварочная
Необходима для приготовления питательных сред. Стены должны быть покрыты плиткой или покрашены масляной краской. Пол выложен плиткой или настелен линолеум. Здесь необходимы электрические или газовые плита, ящик с отсеками для сред в пробирках, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясные среды, холодильник.
Термостатная
Могут быть термостаты разных форм и размеров для выращивания плесневых грибов; температура должна быть 20-25°С, для большинства сапрофитов 25-30°С, для возбудителей инфекционных болезней температура 35-37°С.
Препараторская
Место для работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к лабораторно-практическим занятиям. Здесь располагается всё необходимое для проведения учебного процесса, а также дистиллятор, весы, центрифуга и т.д.
Бокс-комната
Предназначена для посева и пересева культур микроорганизмов и проведения научно-исследовательской работы, которая требует стерильных условий. Комната должна иметь предбоксник (тамбур) с раздвижной дверью, остекленной; стекла должны быть хорошо промазаны, чтобы не проникал воздух из окружающей среды и микроорганизмы.
Стены обложены плиткой или выкрашены масляной краской, на полу линолеум.
Моют бокс влажным способом с применением дезинфицирующих средств: 2-3% раствором соды (Na2HCO3), гидрокарбонатом натрия (NaHCO3) или 3-5% раствор фенола. Воздух стерилизуется бактерицидной лампой (БУВ-15), которая излучает ультрафиолетовые лучи. Стерилизация проводится от 30 мин до нескольких часов. Нахождение в комнате с включенной бактерицидной лампой нежелательно, т.к. УФ лучи вызывают острое воспаление роговицы глаза.
Виварий
Это помещение, где содержат белых мышей, крыс, морских свинок и т.д. Их используют в научно-исследовательских работах, реже на занятиях, поэтому, где нет условий, вивария нет. Реактивы и некоторые биопрепараты хранят в подвальных помещениях или темном стенном шкафу, где сухо, невысокая температура и нет резких колебаний в течение года.
Материалом для лабораторных исследований служат: кровь, моча, кал, мокрота, молоко, фекалии, содержимое абсцессов (гной), полученные при жизни животного, кусочки паренхиматозных органов или других тканей после их гибели, пробы объектов окружающей среды. Материал исследуют бактериологическими, серологическими, гистологическими, биохимическими, микологическими и токсикологическими методами, для чего должны быть созданы необходимые условия (оборудование, специально отведенные помещения)
В лаборатории выделено специальное место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы специальных красителей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой, банкой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами. В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.
Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей предназначена следующая аппаратура:
Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов составляет 37°С. Термостаты бывают воздушными и водяными.
Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.
Холодильники. Используют в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, сывороток, вакцин и прочих биологических препаратов при температуре около 4°С. Для хранения препаратов ниже 0°С предназначены низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура —20 °С и ниже.
Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги с различными режимами работы.
Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Предназначен для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.
Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).
Для уничтожения микроорганизмов в воздухе и на поверхностях существуют различные способы дезинфекции.
Воздух в лаборатории частично очищают проветриванием. Вентиляция резко снижает численность микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице температур снаружи и внутри помещения. Продолжительность проветривания не менее 30...60 мин.
Более эффективный способ обеззараживания воздуха — воздействие ультрафиолетовым излучением (УФИ), обладающим высоким антимикробным действием и вызывающим гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. Стерилизация 30 мин до нескольких часов в зависимости от степени загрязненности воздуха.
Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего используют 0,5...3%-й водный раствор хлорамина. Особенно тщательно следует дезинфицировать поверхность стола, на котором проводится работа с микроорганизмами. Ее необходимо протирать дезинфицирующим раствором как перед началом работы, так и после окончания.
Правила и техника безопасности при работе в лаборатории.
· Заходить и работать в микробиологической лаборатории только в халате, чепчике, бахилах.
· Не вносить в лабораторию посторонних вещей
· Работать на одном и том же месте и пользоваться закрепленным оборудованием
· Соблюдать чистоту и опрятность
· Во избежание заражения во время перерыва в работе не курить и не есть
· Работая с каким-либо материалом работать как с особо опасным предметом
· По окончании занятий рабочее место и оборудование приводить в порядок
· Во избежание взрыва не зажигают одну спиртовку от другой
· Не прикасаются металлическими предметами к проводам и контактными частями электросети
· Без разрешения преподавателя или обслуживающего персонала не включать оборудование
· Соблюдать правила обращения с химическими и другими реактивами
· Уходя, вымыть руки материал, используемый на учебных занятиях, принимают за особо опасный;
· При распаковке материала, присланного для исследования, необходимо соблюдать осторожность: банки снаружи обтирают дезинфицирующим раствором и ставят только на подносы или кюветы;
· При исследовании поступившего материала и при работе с бактериальными культурами соблюдают общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность инфицирования работника;
Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.
Цель занятия: научиться пользоваться микроскопом, изучить морфологию микроорганизмов.
Материалы: микроскоп, колбы, чашки Петри, штативы с пробирками, иммерсионное масло, предметные и покровные стекла
При выполнении любых микробиологических исследований необходимо точно знать особенности строения микроорганизмов. Эти сведения могут быть получены только путем изучения данного организма с помощью микроскопа. Первый простейшего устройства оптический микроскоп был сконструирован Антони ван Левенгуком (рис. 1).
В настоящее время многие вопросы цитологии микробов решаются на уровне электронной микроскопии. Микробиологические лаборатории оснащены микроскопами различных моделей: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др. Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные (способность окрашиваться теми или иными красителями) свойства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).
Современный микроскоп состоит из оптической и механической частей. К механической части относятся штатив, тубус (труба) с револьверным устройством, предметный столик, механизм тонкой и грубой наводки (рис. 1).Штатив состоит из двух частей: держателя трубы микроскопа и массивной которая служит опорой микроскопа.
 |
Рис. 1. Устройство оптического микроскопа:
1— основание микроскопа; 2 — рукоятка макрометрического винта; 3 — тубусодержатель; 4—тубус; 5—окуляр; 6— револьвер объективов; 7—объектив; 8—предметный столик; 9—конденсор; 10— осветитель; 11 — рукоятка микрометрического винта
На штативе укреплен подвижный столик, который приводится в движение двумя винтами, расположенными по его бокам. При помощи этих винтов препарат вместе со столиком вращается и перемещается в разных направлениях, что облегчает его рассмотрение.
В тубусе находится оптическая система. Он перемещается вверх и вниз при помощи двух винтов. Для более грубого перемещения служит зубчатка, или кремальера. Точная установка достигается движением микровинта с мелкой нарезкой: полный оборот микровинта передвигает тубус на 0,1 мм.
В нижней части тубуса имеется револьверное устройство, в которое можно ввинчивать 4 объектива (на некоторых микроскопах 5) и переключать их во время работы. В верхнее отверстие тубуса вставляется окуляр.
Оптическая часть микроскопа состоит из окуляров, объективов, конденсора и зеркала.
Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор для освещения препарата. Одна сторона зеркала плоская; ею пользуются при любом источнике света и при любом увеличении. Другая, вогнутая, сторона зеркала предназначена для работы без конденсора при малых увеличениях.
Конденсор состоит из нескольких линз, собирающих отраженный зеркалом свет в пучок и направляющих его па плоскость препарата. В нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, посредством которой можно менять угол лучей и количество пропускаемого конденсором света. Фокусировку конденсора осуществляют специальным микровинтом.
Наиболее важная часть микроскопа — объектив. Он представляет собой систему линз, строящих действительное, увеличенное и перевернутое изображение объекта. Используют 2 типа объективов: погруженный (иммерсионный), сухой. Иммерсионный объектив дает наибольшее увеличение. Используют кедровое масло.
Окуляр микроскопа — это увеличивающая оптическая система, через которую рассматривается действительное изображение объекта, которое дает объектив. Окуляр состоит из двух линз: собирающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними находится диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Окуляр еще раз увеличивает построенное объективом изображение объекта, но не раскрывает новых деталей его строения.
Классификация (таксономия) микроорганизмов. Вначале в основу классификации микроорганизмов были положены морфологические признаки, так как больше о них человек ничего не знал. В 1896 г. К. Леман и Р. Нейман предприняли попытки объединить микроорганизмы в три группы: шаровидные (Соссасеае), палочковидные (Bacteriaceae) и извитые (Spirillaceae). В 1897 г. для систематики микробов стали использовать наряду с морфологическими и физиологические признаки. Как выяснилось впоследствии, для научно обоснованной классификации одних каких-нибудь признаков бывает недостаточно. Поэтому в настоящее время используют комплекс признаков: фенотипические (морфологические, культуральные, физиологические и другие свойства), а также генотипические (физико-химические свойства ДНК).
Для обозначения микроорганизмов принята двойная (бинарная) номенклатура, которая включает в себя названия рода и вида. Родовое название пишется с прописной буквы, видовое, даже происходящее от фамилии, — со строчной. Например, бациллу сибирской язвы называют Bacillus anthracis, кишечную палочку — Esherichia coli, возбудителя эмфизематозного карбункула — Clostridium chauvoei и т. д.
Основной (низшей) таксономической единицей является вид. Виды - в роды, роды — в семейства, семейства — в порядки, порядки — в классы, классы — в отделы, отделы — в царства.
Вид — это совокупность популяций, имеющих общее происхождение и генотип, морфологические, физиологические и другие признаки, способные в определенных условиях вызывать одинаковые процессы.
Культура — микроорганизмы, полученные от животного, человека, растения или субстрата внешней среды и выращенные на питательной среде. Чистые культуры состоят из особей одного вида, смешанные представляют собой скопления клеток разных видов. Микробиологи часто употребляют слово «штамм».
Штамм — это культура -одного и того же вида, выделенная из разных сред и отличающаяся незначительными изменениями свойств (неодинаковая биохимическая активность, чувствительность к лекарственным веществам и т. д.). Например, кишечная палочка, выделенная от крупного рогатого скота, и такая же палочка, выделенная от свиней, могут быть разными штаммами.
Клон — культура микроорганизмов, выделенная из одной клетки.
В названиях микробов, различающихся по некоторым свойствам, вместо суф- фикса «тип» введен суффикс «вар». Так, биотип называют биовар, серотип — серовар, фаготип — фаговар и т. д.
Форма и строение микробов. Микробы - одноклеточные бесхлорофилльные организмы прокариотического типа. По форме отмечают палочковидные, извитые микробы. Основными формами имеются переходные (коккобактерии и др.).
Шаровидные (кокковые Соссасеае) микробы по форме напоминают шар, но бывают овальные, плоские, односторонне вогнутые или слегка вытянутые.Характеризуются отсутствием подвижности и способности к спорообразованию, однако некоторые бактерии способны образовывать цисты. Шаровидные формы образуются в результате деления клеток в одной, двух, трех взаимно перпендикулярных или разных плоскостях. При делении клеток в одной плоскости клетки могут располагаться попарно, в связи, с чем такие формы получили название диплококков. Если деление происходит последовательно в одной плоскости и клетки соединены в виде цепочки — это стрептококки. Деление кокка в двух взаимно перпендикулярных плоскостях ведет к образованию четырех клеток, или тетракокка. Пакетообразные кокки, или сарцины, — результат деления кокков в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Беспорядочное расположение клеток или образование скоплений, напоминающих гроздья винограда, происходит при делении кокков в разных плоскостях; такие формы называются стафилококками.
Рис. 2. Основные формы микроорганизмов (схема): шаровидные: 1— стафилококки, 2 — диплококки, 3 — стрептококки, 4 — тетракокки, 5— сарцины; палочковидные: 6—бактерии, 7—стрептобакте-рии, 8— бациллы, 9— стрептобациллы; извитые: 10— вибрионы, 11 — спириллы, 12 — спирохеты
Палочковидные, или цилиндрические (Bacteriaceae) формы принято делить на бактерии, бациллы и клостридии. Вытянутой формы, концы могут быть ровными, заостренными, закругленными. Имеются подвижные и неподвижные представители. Движение зависит от видовой принадлежности, возраста культуры и условий выращивания. Подвижные формы передвигаются с помощью жгутиков. Некоторые бактерии могут образовывать споры, которые служат для переживания неблагоприятных внешних условий, отличаются высокой устойчивостью к колебаниям температуры, высушиванию, воздействию химических веществ. Они имеют утолщенную стенку, низкое содержание воды, замедленные метаболические процессы. После формирования споры оболочка и содержимое материнской клетки разрушается. Попадая в благоприятные условия спора, превращается в вегетативную клетку. Бактерии — палочковидные формы, не образующие спор (пишут Bact., например Bact. aceti). Бациллы (аэробы)— палочковидные формы, образующие споры (пишут Вас. например Вас. subtilis). Клостридии (анаэробы) - палочковидные формы, образующие споры, превышающие по ширине вегетативную клетку. Такие формы напоминают веретено, ракетку, лимон, барабанную палочку.
Плеоморфизм – изменение формы в процессе развития. Клостридии принимают, участие во многих процессах в природе. Являются возбудителями анаэробных инфекций. Вызывают аммонификацию белковых веществ, мочевины. Разлагают фосфорорганические соединения. Фиксируют молекулярный азот.
Палочки, как и кокки, могут располагаться попарно или цепочкой. При соединении бактерий попарно образуются диплобактерии, при таком же соединении бацилл — диплобациллы.
Извитые формы микробов (Spirillaceae) определяют не только по длине и диаметру, но и по количеству завитков. Вибрионы напоминают по форме запятую.
Спириллы — извитые формы, образующие до 3—5 завитков, подвижны. Спирохеты — тонкие длинные извитые формы с множеством завитков. Подвижны. Имеют первичные (изгиб протоплазматического цилиндра) и вторичные (изгибы всего тела) завитки. Могут образовывать цисту.
По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие бактерии: монотрихи — бактерии с одним полярно расположенным жгутиком , амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах; лофотрихи — бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки; перитрихи — бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Бактерии, не имеющие жгутиков, называют атрихиями. Нить жгутика состоит из 3 частей: крюк, базальное тельце. Наличие жгутиков у бактерий зависит от температуры их выращивания.
Бактерии передвигаются беспорядочно, однако они способны к направленным формам движения — таксисам, в зависимости от внешних стимулов. Реагируя на различные факторы окружающей среды, бактерии за короткое время локализуются в оптимальной зоне обитания. Таксис может быть положительным и отрицательным. Принято различать: хемотаксис, аэротаксис, фототаксис, магнитотаксис.
Тема №3 «Бактериологические красители. Техника приготовления окрашенных препаратов бактерий. Простые и сложные методы окраски»
Цель занятия: изучить состав красителей, научиться делать мазки и мазки-отпечатки, изучить методы и технику окрашивания.
Материалы и оборудование: предметные стекла, спиртовки, реактивы для окрашивания, фильтровальная бумага, сифон с дистиллированной водой.
Бактерии микроскопируют в живом и неживом виде. Исследование в живом состоянии необходимо для определения «подвижности» (метод «висячей» или «раздавленной» капли). Для изучения морфологии бактерий (формы и структурных элементов), тинкториальных особенностей (способность воспринимать окраску) применяют окрашивание в неживом состоянии.
Для окрашивания применяют анилиновые красители (основные и нейтральные), кислые краски непригодны (вследствие химического состава клетки). Для микроскопирования используют различные методы окрашивания, которые требуют красителей разного цвета: кристалл-, метил-, генцианвиолет – фиолетовый цвет; фуксин, сафранин – красный; метиленовый синий – синий; малахитовый или бриллиантовая зелень – зеленый. Эти красители поступают в продажу в виде порошка или кристаллов, из которых готовят насыщенный спиртовой раствор, но к непосредственной окраске они непригодны. Из насыщенных спиртовых растворов готовят водно-спиртовые растворы, путем добавления дистиллированной воды. Такие растворы менее стойкие, но применяются длительное время. В отдельных случаях готовят раствор красителей, которые используют в свежеприготовленном виде.
Для повышения действия спиртоводных растворов красок применяют протраву(разрушает клеточную оболочку). Физическая протрава нагревание: использование горячих растворов красителей или раствор краски наливают на препарат и снизу подогревают на пламени до появления паров. Химическая протрава фенол, КОН, которые добавляют к растворам красителей или перед окрашиванием препарат обрабатывают слабыми растворами кислот (HCl, H2SO4) после чего смывают водой и окрашивают. Из спиртоводных растворов используют: карболовый фуксин (фуксин Циля, фуксин Пфейффера), генцианвиолет, метиленовый синий (щелочной раствор Лефлера), водный раствор сафранина, малахитовая или бриллиантовая зелень.
Препарат для микроскопирования готовят на предметном стекле. Материалом может быть: гной, кровь, взвесь бактериальных культур – препараты-мазки, а из ткани органов (печень, селезенка, лимфоузлы) – препараты-отпечатки.
Высушенный на воздухе мазок фиксируют – закрепляют на стекле (и обеззараживают). Фиксация выполняет следующие функции: быстро убивает микроорганизмы (медленная гибель ведет к аутолизу), обеспечивает лучшее прилипание к стеклу, делает мазок более восприимчивым к окраске (у мертвых клеток нарушена целостность мембран). Физический способ оборотной стороной мазка 2-3 раза слегка проводят над пламенем горелки. Химический способ использование спирта, эфира, формалина, смеси Никифорова (спирт+эфир 1:1), жидкость Карнуа (спирт+хлороформ+ледяная уксусная кислота). Высушенный мазок опускают в стакан с фиксирующей жидкостью или капают 1-2 капли на препарат на 3-5 минут, промывают, сушат.
Окрашивание – совокупность методов и приемов для исследоания внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, матод микробиологической техники, позволяющие различать виды микроорганизмов.
Простой метод окраски. При данном методе используют только один краситель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают красящий раствор (метиленовой сини 4...5 мин, генцианвиолет 1-2 мин). Краску смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препарат помещают на предметный столик и микроскопируют. Данный метод позволяет быстро ознакомиться с микрофлорой мазка.
Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свойства каждого вида микроба.
Метод окраски по Граму. Фиксированный препарат окрашивают карболовым генцианвиолетом в течение 2...3 мин. Не смывая водой, краску сливают и на 2...3 мин на препарат наносят раствор Люголя (йода кристаллического — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дистиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-м спиртом в течение 30 с, затем хорошо промывают водой. После этого препарат дополнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микроскопируют.
При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными (фирмикутные). Другие виды обесцвечиваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными (грациликутные). Окрашивание по Граму обусловлено структурными особенностями клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептидогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты цитоплазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с многослойным пептидогликановым каркасом (грамположительные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохождение спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обесцвечивается.