Крім сигналів, що визначають місце локалізації цитозольних білків, існують сигнали, що визначають час їх життя. Більшість постійних білків цитозоля існує відносно довго – декілька днів. Інші деградують скоріше, впродовж декількох хвилин після їх синтезу. До таких білків належать ферменти, що каталізують “швидкі” стадії метаболізму та білки - продукти клітинних онкогенів fos та mys, що відіграють важливу роль в регуляції росту та поділу клітини.
Більшість неправильно згорнутих, денатурованих та аномальних білків (білки, що виникли в результаті помилок синтезу, хімічних пошкоджень, а також мутантні форми білків) руйнуються в цитозолі за допомогою одного і того ж протеолітичного механізму. Суть цього механізму полягає в тому, що білки, які підлягають швидкому руйнуванню, несуть сигнали, що вмикають деградаційний протеолітичний механізм. Один з таких сигналів дуже простий, він являє собою лише першу амінокислоту в поліпептидному ланцюзі. Амінокислоти Met, Ser, Ala, Val, Gly та Pro, коли вони знаходяться на N-кінці, є стабілізуючими, а інші 12 амінокислот викликають протеолітичну атаку. Ці дестабілізуючі амінокислоти практично ніколи не зустрічаються на N-кінці стабільних білків цитозолю. Але вони часто присутні на N-кінці білків, що переносяться в інші компартменти, наприклад, ЕР. Оскільки цитозольний протеолітичний механізм відсутній в порожнині ЕР або апарату Гольджі, такі білки в “своїх” компартментах є довго живучими. Дестабілізуюча N-кінцева амінокислота таких нецитозольних білків може слугувати в клітині для видалення тих копій, що направляються помилково: молекули, що не можна швидко перенести з цитозолю руйнуються.
Протеолітичний механізм, що відповідає за вибіркову деградацію цитозольних білків, є складним, і будучи запущеним, гарантує повне руйнування білку. Прикладом може слугувати убікитин – залежний протеоліз. При такому протеолізі з білком, що підлягає руйнуванню, з’єднуються численні копії невеличкого білку убікитину (убіквитину), термостабільного білку з 76 амінокислотних залишків.
Приєднання до білку однієї молекули убікитину є оборотною модифікацією, що грає регуляторну роль. Однак додавання до білку розгалуженого убікитинового ланцюгу викликає його швидку та повну деградацію. Зв’язування убікитину з білком-мішенню каталізується багатоферментним комплексом, який, як вважають приєднується до N-кінця білку, що несе дестабілізуючу N-кінцеву амінокислоту. Цей ферментний комплекс приєднує молекулу убікитину до найближчого залишку лізіну в поліпептиді, а потім додає до першої інші молекули убікитину, формуючи розгалужений убікитиновий ланцюг. Після цього АТФ-залежна протеаза швидко руйнує білки. Субстратом для цієї протеази слугують лише білки, що містять поліубікитинові розгалужені ланцюги, а білки, що містять лише одну молекулу убікитину, зв’язану з лізином, наприклад, гістони, зберігаються.
Слід зазначити, що аномальні білки існують в будь якій клітині. Але за певних умов, при тепловому шокові, наприклад, їх кількість в клітині різко зростає. Це спричинює синтез великої кількості згаданих вже вище білків теплового шоку, які здатні переводити в розчин агреговані та заново згортати неправильно згорнуті цитозольні білки шляхом декількох циклів приєднання та гідролізу АТФ.
Цитозольє частиною цитоплазми, що займає простір між мембранними органелами. Як правило, на його долю приходиться майже половина загального об'єму клітини. До складу цитозолю входять численні ферменти проміжного обміну та білкові ферменти, зібрані у фібрілярний цитоскелет. Саме цитоскелет зумовлює форму клітини, забезпечує рух цитоплазми та утворює загальну мережу, яка організує ферментативні реакції. Білки цитозолю складають близько 20% його маси, тому він є скоріш високоорганізованим гелем, ніж розчином ферментів. Дослідження швидкості дифузії, однак, показують, що малі молекули та невеликі білки дифундують в цитозолі з тією ж швидкістю, що і в дистильованій воді. Тобто, з боку проміжного обміну (де і субстрати, і продукти є малими молекулами) ми можемо вважати цитозоль простим розчином.
Близько половини всіх білків, синтезованих на рибосомах, залишаються саме в цитозолі як його постійні компоненти.
Утримання Утримання
Утримання
Рис.4.1.1. Спрощена схема шляхів метаболізму білків.
Більш того, практично всі білки (за виключенням окремих мітохондріальних та хлоропластних) починають свій синтез на рибосомах цитозолю, і лише в процесі синтезу їх шляхи розходяться. Білки, що належать до однієї транспортної гілки, після завершення їх синтезу виділяються в цитозоль. Деякі з них містять специфічні сигнали сортування, які направляють їх до мітохондрій, хлоропластів (у рослин), ядра або пероксисом. Інші, що становлять більшість, не мають специфічних сигналів сортування, саме вони і залишаються в цитозолі як постійні компоненти.
Друга транспортна гілка реалізується при синтезі білків, призначених для виведення з клітини, а також білків - компонентів ЕР, апарату Гольджі, плазмалеми або лізосом. Всі ці білки в процесі їх утворення переносяться в ЕР за допомогою сигналів сортування, розташованих на N - кінці.
Як правило, проходить не більше 1-2 хвилин з часу вивільнення білку в цитозолі до його надходження у відповідну органелу. Білки, призначені для ядра, мітохондрій або пероксисом, досягнувши відповідних органел, на цьому закінчують свій шлях. Білки ж, що надходять до ЕР, залучаються до подальшого транспорту, що здійснюється вже за допомогою транспортних пухирців та може тривати не одну годину.
Слід підкреслити, що в цитозолі існує два принципово різних транспортних процеса, що забезпечують переміщення хімічних комплексів, білків, в першу чергу, з одного компартменту в інший. По–перше - вони можуть безпосередньо проникати через мембрану, потрапляючи з простору, топологічно еквівалентному цитозолю, в простір, топологічно еквівалентний позаклітинному, і навпаки. Цей шлях вимагає наявності в мембрані білка-транслокатора, крім того, молекула білку, що транспортується повинна розвернутися. Таким шляхом здійснюється транспорт білків з цитозолю в порожнину ЕР.
Інший шлях транспортування білкових молекул в цитозолі опосередкований транспортними пухирцями. Такі пухирці захоплюють певні молекули в порожнині одного компартмента (від якого вони відшнуровуються) та переносять їх в інший компартмент, зливаючись з ним. За участю такого везикулярного транспорту білки не перетинають ніяких мембран, тому вони переносяться лише між компартментами, топологічно еквівалентними один одному, ЕР-ом та апаратом Гольджі, наприклад.
Обидва типи транспортних процесів контролюються за участю спеціальних білків, що виконують роль сигналів сортування. У білків, що безпосередньо переносяться через мембрану, ці сигнали розпізнаються транслокаторами в мембрані. А в транспортний пухирець білок потрапляє, якщо сигнал сортування зв’язується з рецепторами на мембрані пухирця.
Припускають, що на цитозольних білках існує два типи сигналів сортування.
Рис.3.2.
Для деяких етапів транспорту сигналами сортування є ділянка амінокислотної послідовності, довжиною 15-60 залишків. Коли ця стадія залишається пройденою, такий сигнальний пептид відрізається. Сигналами сортування для інших стадій, ймовірно, слугує певна тримірна структура, утворена атомами поверхні білку при звертанні його молекули. Амінокислотні залишки, що формують такі сигнальні ділянки, можуть розташовуватись на певній відстані один від одного в лінійній послідовності білку. Сигнальні пептиди направляють білки з цитозолю в ЕР, мітохондрії, хлоропласти та ядро; вони також відповідають за те, що певні білки залишаються в ЕР. Сигнальні ділянки, як правило, залучаються до розпізнання певних лізосомних білків спеціальним ферментом в апараті Гольджі.
Таким чином, щоб з’ясувати пункт призначення того, чи іншого білку в цитозолі, необхідно визначити тип його сигнального пептиду. Білки, що повинні потрапити в порожнину ЕР, як правило, несуть N-кінцевий сигнальний пептид, центральна частина якого утворена 5-10 гідрофобними амінокислотними залишками. Більшість цих білків направляється з ЕР в апарат Гольджі; ті ж, що мають на С-кінці специфічну послідовність з 4-ьох амінокислот, залишаються як постійні компоненти в ЕР. Більшість білків, призначених для мітохондрій, мають сигнальні пептиди, в яких позитивно заряджені амінокислотні залишки чергуються з гідрофобними. Серед білків, що направляються до ядра, більшість має сигнальні пептиди, утворені кластером позитивно заряджених амінокислотних залишків. І нарешті, деяким білкам цитозолю притаманні сигнальні пептиди, з якими ковалентно з’вязується жирна кислота, що направляє ці білки до мембран без проникнення до ЕР.
Важливу роль у вирішенні долі цитозольних білків відіграє їх післятрансляційна модифікація, більш ніж 100 типів якої відомо нині. Реальна роль деяких модифікацій не з’ясована, деякі з них випадкові і не мають функціонального значення, але більшість з них важливі для клітини і чітко контролюються специфічними ферментами. Слід сказати, що певні післятрансляційні модифікації можуть відбуватися і в ЕР, і в апараті Гольджі, наприклад гікозилювання. Єдиний відомий випадок гікозилювання в цитозолі клітин ссавців – це додавання N-ацетілглюкозаміну до залишків серину та треоніну в білках. Таким чином модифікуються білки-регулятори більшості генів та деякі білки ядерних пор. Значення цієї модифікації невідомо.
Більшість же інших ковалентних модифікацій відбувається в першу чергу саме в цитозолі. Деякі з них стабільні і необхідні для активності білка, наприклад, ковалентне приєднання коферментів (біотину, ліпоєвої кислоти, пиридок-саль-фосфату). Інші ковалентні модифікації, що відбуваються в цитозолі, оборотні і слугують для регуляції активності білків. Найпоширенішою з цих модифікацій є фосфорилювання ОН-груп бічних ланцюгів серину, треоніну та тирозину в білках. В тваринних клітинах таким чином модифіковано майже 10% білків цитозолю. Крім фосфорилювання важливу роль відіграють реакції оборотного метилування та оборотного ацетилування.
Серед відомих цитозольних модифікацій білків, описана ще одна, що є надзвичайно важливою для їх доставки до місця призначення. Приєднання жирної кислоти до водорозчинного білку направляє його до певних мембран, обернених в цитозоль. Такі білки ковалентно зв’язуються з ланцюгом жирної кислоти, яка потім вбудовується в ліпідний бішар з цитоплазматичного боку, заякорюючи в ньому білок. Зв’язування цитозольниого білку з мембраною через жирну кислоту може мати важливі функціональні наслідки.
Рис.3.3.
Наприклад, онкоген src вірусу саркоми Рауса кодує тирозин-специфічну протеїнкіназу, яка найчастіше зв’язується з мембраною за допомогою ковалентно приєднаного ланцюгу мирістинової кислоти (ненасиченої жирної кислоти з 14 вуглецевими атомами). В такій конфігурації ця протеїнкіназа перетворює нормальну клітину в пухлинну. Якщо ж приєднанню жирної кислоти передує заміна в молекулі білка N-кінцевого гліцину на аланін, то src-білок зберігає свою активність як протеїнкіназа, але залишається в цитозолі та не трансформує клітини. Очевидно, що для ефективного зв’язування з субстратом ця кіназа повинна бути прикріплена до мембрани.
При інших дослідженнях було показано, що продукт іншого онкогенну, білок ras , для того, щоб трансформувати клітину, повинен прикріпитися до мембрани через ковалентно приєднаний ланцюг пальмітинової кислоти (ненасиченої жирної кислоти з 16 вуглецевими атомами).
Чим зумовлюється, чи приєднується до даного білку ланцюг жирної кислоти і яка це кислота: мирістинова чи пальмітинова? Ферменти, що каталізують дані модифікації, розпізнають різні сигнальні пептиди в білку: ланцюг міристинової кислоти додається до N-кінцевого залишку гліцину, розташованого всередині певної амінокислотної послідовності, а ланцюг пальмітинової кислоти приєднується до бічного ланцюгу цистеїну, розташованого за 4 залишки від карбоксильного кінця у складі іншого сигнального пептиду.
Крім згаданих вище, в цитозолі відбувається реакція, що каталізується іншим ферментом, в ході якої ланцюги пальмітинової кислоти додаються до обернених до цитозолю кінцям багатьох трансмембранних білків, по мірі того, як вони проходять з ЕР до апарату Гольджі на шляху до плазматичної мембрани.
Крім сигналів, що визначають місце локалізації цитозольних білків, існують сигнали, що визначають час їх життя. Більшість постійних білків цитозоля існує відносно довго – декілька днів. Інші деградують скоріше, впродовж декількох хвилин після їх синтезу. До таких білків належать ферменти, що каталізують “швидкі” стадії метаболізму та білки - продукти клітинних онкогенів fos таmys, що відіграють важливу роль в регуляції росту та поділу клітини.
Більшість неправильно звернутих, денатурованих та аномальних білків (білки, що виникли в результаті помилок синтезу, хімічних пошкоджень, а також мутантні форми білків) руйнуються в цитозолі за допомогою одного і того ж протеолітичного механізму. Суть цього механізму полягає в тому, що білки, які підлягають швидкому руйнуванню, несуть сигнали, що включають деградаційний протеолітичний механізм. Один з таких сигналів дуже простий, він являє собою лише першу амінокислоту в поліпептидному ланцюзі. Амінокислоти Met, Ser, Ala, Val, Gly та Pro, коли вони знаходяться на N-кінці, є стабілізуючими, а інші 12 амінокислот викликають протеолітичну атаку. Ці дестабілізуючі амінокислоти практично ніколи не зустрічаються на N-кінці стабільних білків цитозолю. Але вони часто присутні на N-кінці білків, що переносяться в інші компартменти, наприклад, ЕР. Оскільки цитозольний протеолітичний механізм відсутній в порожнині ЕР або апарату Гольджі, такі білки в “своїх” компартментах є довго живучими. Дестабілізуюча N-кінцева амінокислота таких нецитозольних білків може слугувати в клітині для видалення тих копій, що направляються помилково: молекули, що не можна швидко перенести з цитозолю руйнуються.
Протеолітичний механізм, що відповідає за вибіркову деградацію цитозольних білків, є складним, і будучи запущеним, гарантує повне руйнування білку. Прикладом може слугувати убікитин – залежний протеоліз. При такому протеолізі з білком, що підлягає руйнуванню, з’єднуються численні копії невеличкого білку убікитину (убіквитину), термостабільного білку з 76 амінокислотних залишків.
Рис. 3.4.
Приєднання до білку однієї молекули убікитину є оборотною модифікацією, що грає регуляторну роль. Однак додавання до білку розгалуженого убікитинового ланцюгу викликає його швидку та повну деградацію. Зв’язування убікитину з білком- мішенню каталізується багатоферментним комплексом, який, як вважають приєднується до N-кінця білку, що несе дестабілізуючу N-кінцеву амінокислоту. Цей ферментний комплекс приєднує молекулу убікитину до найближчого залишку лізіну в поліпептиді, а потім додає до першої інші молекули убікитину, формуючи розгалужений убікитиновий ланцюг. Після цього АТФ-залежна протеаза швидко руйнує білки. Субстратом для цієї протеази слугують лише білки, що містять поліубікитинові розгалужені ланцюги, а білки, що містять лише одну молекулу убікитину, зв’язану з лізином, наприклад, гістони, зберігаються.
Слід зазначити, що аномальні білки існують в будь якій клітині, але при певних впливах, при тепловому шокові, наприклад, їх кількість в клітині різко зростає. Це спричинює синтез великої кількості білків теплового шоку, що забезпечується активацією транскрипції певних генів. В клітинах дріжджів S. cerevisiae, наприклад, є 8 hsp 70- генів (генів, що кодують білки теплового шоку родини 70 кДа), деякі з них транскрибуються при будь яких умовах, інші лише при дії високих температур та інших екстремальних факторів. Було показано, що такі білки здатні переводити в розчин та заново згортати агреговані чи неправильно звернуті цитозольні білки шляхом декількох циклів приєднання та гідролізу АТФ.
Утримання Утримання
Утримання
Рис.4.1.1. Спрощена схема шляхів метаболізму білків.
| Послідовності, що утворюють сигнальну ділянку | |
Рис.3.2. Два способи формуванні у білку сигнального сигналу.
Рис.3.3. Ковалентне приєднання до білку жирної кислоти направляє водорозчинний білок у мембрану.
| |
| | | Точка приєднання до бічних ланцюгів залишків лізину у білках | |
| Гідрофобна серцевина молекули | |
Рис. 3.4. Тримірна структура убікітину (убіквітину).
| | | | |
| | | | | Комплекс убікітин - білок | |
| Убікітин повертається у кругообіг | |
| Вивіль- нення убікітину (убікітинзалежна протеаза) | |
| Ферментний комплекс, що приєднує убікітин | |
Рис. 3.4. Убікітин-залежне руйнування білків.
