Рааздел i. фундаментальные аспекты медицинской науки
Направление фундаментальных исследований РАМН
Раздел I.Фундаментальные аспекты медицинской науки
Направление 4.Клеточные технологии: в создании новых методов диагностики, использовании стволовых клеток для лечения социально значимых заболеваний и созданий новых лекарственных средств.
Актуальность темы:
Методология развитие клеточных технологий включает разработку технологических регламентов получения кандидатных клеток, оценки их биологической активности in vitro и in vivo, а также критериев безопасности и клинической эффективности при проведении клинических испытаний. При создании технологий на основе использования аутологичных клеток (т.е. пациент-зависимых технологий) возникают дополнительные задачи, связанные с оценкой функциональной полноценности кандидатных клеток больных (т.е. при патологии) и разработки при необходимости подходов к коррекции/направленной регуляции клеточных дисфункций.
Планируемое исследование, включающее вышеперечисленные аспекты методологии разработки клеточных технологий, будет включать три направления:
1) разработку технологий стимуляции репаративных процессов при различных иммунопатологических состояниях с помощью мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и макрофагов (МФ)
2) изучение прогностической роли прогениторных и иммунокомпетентных клеток как предикторов регенеративного ответа и/или эффективности клеточных технологий
3) Изучение патогенетической роли и разработка подходов к направленной регуляции функций стволовых/прогениторных клеток в моделях иммунопатологических состояний на животных
Первое направление. Разработка клеточных технологий стимуляции репаративных процессов является одним из интенсивно развивающихся направлений регенеративной медицины [Korbling, 2003; Anderson 2001; Viswanathan, 2011]. Основанием данного направления послужили многочисленные экспериментальные исследования о позитивном клиническом эффекте различных типов трансплантируемых клеток в моделях повреждения органов и тканях. Первоначально основной интерес в области регенеративной медицины был сосредоточен на стволовых клетках, а их эффект связывали с клеточным замещением. Позже, выяснилось, что влияние трансплантируемых клеток в значительной степени обусловлено паракринными эффектами, направленными на подавление апоптоза; стимуляцию пролиферации различных типов клеток; рекрутирование и активацию тканеспецифических стволовых клеток (СК); стимуляцию ангиогенеза; подавление воспаления и др. [Chen, 2001; Ohtaki, 2008; Liu, 2006]. Причем стало очевидно, что стимуляция репаративных процессов может опосредоваться не только СК, но и другими типами клеток и в первую клетками моноцитарно-макрофагального ряда.
Проводимые нами ранее исследования были сконцентрированы на изучении регуляторного и регенеративного потенциала мезенхимальных стромальных клеток (МСК), исследовании функций МСК при патологии и разработке подходов к направленной регуляции функциональной активности МСК. Кроме того, отдельный фрагмент исследований был посвящен разработке подходов к генерации макрофагов 2 типа, обладающих противовоспалительной и про-регенераторной активностью и характеристике функций этих клеток. Полученные результаты показали, что общим проявлением изменения функциональной активности МСК костного мозга при патологии является снижение их пролиферативного потенциала, уменьшение супрессорной- и появление при ряде патологий стимуляторной активности [Sergeevicheva, 2010; Шевела, 2010; Шевела, 2008;]. Причем восстановление пролиферативного потенциала с помощью b FGF не всегда приводит к коррекции иммуносупрессорной активности. Регуляторной функции МСК в последние годы отводится большое внимание. Так, способность МСК стимулировать дифференцировку кроветворных предшественников рассматривается в качестве обоснования применения этих клеток для улучшения восстановления кроветворения при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). С другой стороны наличие иммуносупрессорной активности МСК ставит вопрос о необходимости тщательного исследования безопасности применения МСК в плане развития неблагоприятных эффектов иммуносупрессии. Недавние исследования иммунорегуляторной активности МСК показали, что эти клетки характеризуются функциональной дихотомией и могут проявлять как иммуносупрессорную, так и иммуностимулирующую активность, наиболее выраженную при патологических состояниях [Waterman, 2010]. Однако молекулярные основы и значение функциональной дихотомии МСК остаются не исследованными. Поэтому раскрытие механизмов функциональной дихотомии МСК и регуляции их активности, а также более детальное исследование иммуностимуляторной активности МСК представляется, несомненно, актуальным. Проведенные за предшествующий период исследования прорегенераторной активности макрофагов были сконцентрированы на разработке метода генерации М2-подобных макрофагов, и их характеристике [Chernykh, 2010]. Целью дальнейших исследований является характеристика этих клеток в плане экспрессии «М2-ассоциированных» маркеровin vitro и оценки безопасности и эффективности М2-подобных макрофагов в клинических исследованиях.
Второе направление. Исследование стволовых/прогениторных клеток представляет интерес не только с точки зрения потенциальных кандидатов для клеточной терапии, но и оценки «естественного» регенеративного ответа в ответ на выраженные повреждающие воздействия. Согласно данным литературы многие патологические процессы сопровождаются мобилизацией СК из костного мозга в рециркуляцию с последующей миграцией их в зону повреждения. При этом выявление корреляционной связи количества циркулирующих предшественников с фракцией сердечного выброса при инфаркте миокарда [Wojakowski, 2006], выраженностью фиброза при пневмонии [Yamada, 2005], выживаемостью при сепсисе [Rafat, 2007] и эффективностью неврологического восстановления при инсульте [Sobrino, 2007] позволяет предполагать, что циркулирующие костно-мозговые предшественники (КМП) могут отражать интенсивность репаративного ответа и обладать прогностической значимостью. Прогностическая роль КМП, однако, остается мало изученной, особенно при травматическом повреждении головного мозга, при котором системный воспалительный ответ является с одной стороны фактором, индуцирующим мобилизацию КМП, а с другой – фактором вторичного повреждения головного мозга [Werner.2007; Griffiths, 2010]. Поэтому в качестве одной из задач в рамках данного направления планируется охарактеризовать изменения циркулирующих КМП у больных с черепно-мозговой травмой и оценить их значение в прогнозе неврологического восстановления.
Проведение любых клеточных технологий диктует необходимость поиска биомаркеров эффективности лечения/исхода заболевания. Согласно данным литературы в случае трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток таковыми могут быть количественные характеристики клеток продукта сепарации, а также показатели, отражающие эффективность реконституции иммунной системы [Gordan, 2003, Nadal, 2007]. Тем не менее, диагностическая значимость тех или иных маркеров в прогнозе исходов аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток изучена недостаточно. В этой связи еще одной задачей данного направления будет исследование прогностической значимости параметров продукта афереза и показателей реконституции регуляторных Т-клеток в исходе аутологичной трансплантации гемопоэтических СК, проводимой в стандартном режиме и в условиях ко-трансплантации МСК.
Третье направление.Тезис о вовлеченности ранних этапов гемопоэза в формирование ряда иммунопатологических состояний является, с одной стороны, интригующим (существует термин «болезни стволовой клетки»), с другой – данную область знаний нельзя назвать хорошо изученной.
Хронические воспалительные процессы (в т.ч. аутоиммунные, к которым относится ревматоидный артрит) часто сопровождаются формированием анемии [Papadaki, 2002 (5)]. В основе патогенеза анемии хронических заболеваний лежат TNF-опосредованные нарушения пролиферации эритроидных предшественников, продукции эритропоэтина, усиление апоптоза эритроидных предшественников (Seth Rivera, 20098); доказано, что использование анти-TNF антител в лечении анемии при ревматоидном артрите приводит к значительному повышению уровня гемоглобина (Rusten, 2005 7).TNF в настоящее время рассматривается как основная мишень для разработки новых биомедицинских технологий лечения ревматоидного артрита и других воспалительных заболеваний (Kirou 2006, Redlich 2003 3, 6). Существует еще один подход - использование рекомбинантных вирусных белков, блокирующих активность TNF (Гилева, 2009 1).
TNF участвует в патогенезе наиболее часто встречающегося «профессионального» заболевания – контактного дерматита, локального воспалительного процесса, формирующегося в ответ на повреждающее воздействие (Larsen, 1990 4). В ответ на локальную продукцию провоспалительных цитокинов (главным образом TNF) мигрирующие КЛ/ДК переносят захваченный антиген из эпидермиса в дренирующий лимфатический узел, где инициируется системная иммунная реакция. Отмена миграции КЛ/ДК из кожи, вызванная интрадермальным введением антител к провоспалительным цитокинам или к матриксным металлопротеиназам ММП-2 и ММП-9 предотвращает развитие контактной реакции на химические аллергены. В процессе миграции КЛ/ДК генерируются сигналы, рекрутирующие клетки-предшественники костномозгового происхождения в кожу для восполнения КЛ-популяции. Очевидно, что течение аллергических воспалительных реакций зависит от интенсивности пролиферации, дифференцировки и мобилизации гемопоэтических предшественников, чьё поведение зависит от регулирующего воздействия цитокинов, образующихся в очаге воспаления и попадающих в кровоток. Исследование костномозгового гемопоэза (дифференцировочные потенции, мобилизация предшественников из костного мозга в кровь) в процессе формирования экспериментального коллаген-индуцированного артрита, контактного дерматита и влияния на костномозговой гемопоэз TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB позволит обосновать новую биомедицинскую технологию, основанную на использовании вирусных белков с иммуномодулирующей активностью.
Развитие воспаления, индуцированного CCL4, характеризуется фазовым течением процесса: на ранних сроках после введения CCL4 в печени и легких мышей формируются активные гранулемы, преимущественно состоящие из макрофагов и лимфоцитов, а на поздних – происходит замещение клеток соединительной тканью (фиброгенез). В зонах прогрессирующего фиброза уменьшается число функционально активных макрофагов – продуцентов коллагеназы. Предполагается, что макрофаги в инфильтрате перестают продуцировать гемопоэтины и колониестимулирующие факторы, в результате чего уменьшается приток предшественников, способных дифференцироваться в функционально активные макрофаги. Исследование костномозгового гемопоэза, в том числе миграции гемопоэтических предшественников из костного мозга в воспалительный очаг позволит обосновать и оптимизировать клеточные технологии лечения острого и хронического гепатита.
Учитывая все вышеизложенное, была сформулирована цель проекта:
Патогенетически обосновать и разработать новые технологии иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов на основе использования стволовых и иммунокомпетентных клеток в лечении иммунопатологических заболеваний.
Задачи:
1. Разработать новые клеточные технологии иммунорегуляции и стимуляции репаративных процессов (повышение эффективности восстановления гемопоэза и иммунной реконституции после трансплантации стволовых кроветворных клеток, усиление репаративных процессов при заболеваниях центральной нервной системы) на основе изучения иммунорегуляторной и регенеративной активности мезенхимальных стволовых клеток и М2-подобных макрофагов
2. Изучить прогностическую роль прогениторных и иммунокомпетентных клеток как предикторов регенеративного ответа при черепно-мозговой травме (ЧМТ) и исхода аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, в том числе на фоне котрансплантации МСК.
3. Исследовать функциональную активность (пролиферация, дифференцировка, мобилизация) стволовых гемопоэтических клеток в моделях коллаген-индуцированного артрита, контактного дерматита, острого и хронического гепатита; разработать новые биомедицинские технологий коррекции иммунопатологических состояний у экспериментальных животных.
Этап 2013 г.
1) Исследовать in vitro влияние МСК доноров и больных лимфомами на пролиферацию лимфоцитов в ответ на стимуляцию гомеостатическими цитокинами
2) Изучить взаимосвязь между пролиферативной активностью МСК и их иммунорегуляторной активностью.
Ответственный исполнитель ст.н.с. Шевела Е.Я.
3) Исследовать экспрессию М2-ассоциированных молекул, в том числе с проапоптогенной активностью (СD 200R, B7-H1 и др.) на М1 и М2 макрофагах
Ответственный исполнитель ст.н.с. Сахно Л.В.
4) Изучить количественное содержание циркулирующих гемопоэтических и эндотелиальных предшественников у больных с различными исходами черепно-мозговой травмы
5) Исследовать взаимосвязь между мобилизацией КМП и выраженностью системного воспалительного ответа у больных ЧМТ
Ответственный исполнитель гл.н.с. Останин А.А.
6) Исследовать костномозговой гемопоэз (пролиферация, дифференцировка, мобилизация) и показателей периферической крови в динамике развития коллаген-индуцированного артрита; а также изучить гемопоэз-корригирующие эффекты TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB при данной патологии.
Ответственный исполнитель в.н.с., д.м.н., профессор Д.Д. Цырендоржиев
Этап 2014 г.
1) Исследовать влияние различных иммуномодулирующих воздействий на супрессорную и стимуляторную активность МСК (Ответственный исполнитель ст.н.с. Шевела Е.Я.)
2) Исследовать проапоптогенную активность М1 и М2 макрофагов против активированных Т-клеток в культурах алло СКЛ
Ответственный исполнитель ст.н.с. Сахно Л.В.
3) Оценить прогностическую роль циркулирующих костномозговых предшественников в исходе ЧМТ
4) Исследовать прогностическую значимость содержания Т-рег на этапе ранней реконституции как предикторов исхода ТГСК.
Ответственный исполнитель гл.н.с. Останин А.А..
5) Исследовать костномозговой гемопоэз в модели контактного дерматита
6) Изучить гемопоэз-корригирующий эффект TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB в модели контактного дерматита.
Ответственный исполнитель в.н.с., д.м.н. Орловская И.А.
Этап 2015 г.
1) Изучить in vivo эффект ко-трансплантации МСК на восстановление наивных CD4 Т-клеток и CD4 Т-клеток памяти и экспансию СD4+CD31+ Т-клеток в периферической крови пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых кроветворных клеток
Ответственный исполнитель ст.н.с. Шевела Е.Я.
2) Исследовать роль фагоцитоза апоптотических клеток в М1-М2 переключении, индуцированным дефицитом ростовых факторов
Ответственный исполнитель ст.н.с. Сахно Л.В..
3) Исследовать прогностическую значимость различных параметров продукта сепарации (субпопуляционный состав, цитокин-продуцирующая функция клеток сепарата, супрессорная активность прилипающих клеток) в прогнозе исхода трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК)
Ответственный исполнитель гл.н.с. Останин А.А..
4) Исследовать гемопоэзмодулирующий эффекты TNF и эффективность TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы VARV-CrmB при различных путях их введения.
Ответственный исполнитель в.н.с. д.м.н., профессор Орловская И.А.
Этап 2016 г.
1) Оценить безопасность и клиническую эффективность М2-подобных макрофагов в лечении пациентов с патологией центральной нервной системы (ЦНС) – детским церебральным параличом, церебральным инсультом
Ответственный исполнитель ст.н.с. Шевела Е.Я.
2) Оценить клиническую эффективность ко-трансплантации МСК при проведении ТГСК у больных с различными клиническими вариантами злокачественных лимфом
Ответственный исполнитель ст.н.с. Шевела Е.Я.
3) Оценить продукцию цитокинов М1 и М2 макрофагами и исследовать корреляционную зависимость между уровнем продуцируемых цитокинов и экспрессией М2-ассоциированных молекул Ответственный исполнитель ст.н.с. Сахно Л.В.
4) На основе выявленных предикторов разработать новые прогностические модели диагностики исходов при черепно-мозговой травме и эффективности аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток при гемобластозах
Ответственный исполнитель гл.н.с. Останин А.А.
5) Исследовать функциональную активность гемопоэтических стволовых клеток в модели острого и хронического гепатита. Разработать пути коррекции патологических изменений на основе трансплантации мезенхимальных клеток.
Ответственный исполнитель в.н.с., д.м.н., профессор Д.Д. Цырендоржиев
Научный коллектив