Пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.

пределение влияния pH на работу фермента.

Опыт проводили в двух повторностях. К 0,4 мл раствора сахарозы (концентрация 2x10-2 M) добавляли 0,1 мл разведённого в 5000 раз раствора фермента в буфере с различным pH (3,2 – 7,2). В течение 9 минут проводили инкубацию при температуре 30oC. Поcле проведения гидролиза добавляли 2 мл раствора ДНСК и ставили пробирку на кипящую водяную баню на 15 минут. Растворы охлаждали, добавляли 7,5 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при λ = 470 нм.

pH раствора фермента 3,2 4,2 5,2 6,2 7,2
D470 средн. 0,120 0,314 ± 0,001 0,339 ± 0,038 0,334 ± 0,002 0,095 ± 0,035

Определение термостабильности фермента инвертаза.

Определение проводили в трёх повторностях. В отличии от предыдущих опытов, pH гидролиза был оптимальным – 5,2. Концентрация субстрата - 3x10-2 M. Раствор фермента изначально был прогрет до 35-65 градусов с интервалом в 5oC. Определение концентрации продуктов проводили аналогично. Результаты приведены в таблице и графике.

Темп. предварит. прогрева 1-я проба 2-я проба 3-я проба Среднее значение
Без прогрева 0,387 0,381 0,342 0,370 ± 0,024
35oC 0,337 0,348 0,293 0,326 ± 0,029
40oC 0,438 0,363 0,341 0,353 ± 0,016
45oC 0,243 0,248 0,252 0,248 ± 0,005
50oC 0,324 0,339 0,333 0,332 ± 0,008
55oC 0,277 0,289 0,325 0,297 ± 0,025
60oC 0,130 0,130 0,158 0,139 ± 0,016
65oC 0,014 0,000 0,000 0,005 ± 0,008

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

пределение удельной активности фермента.

Удельная активность фермента рассчитывается как отношение вступившего в реакцию субстрата на единицу времени и единицу массы фермента.

Для расчётов была выбрана точка 9` при концентрации субстрата 0,01М в первом опыте. В результате гидролиза образовалось 489,2 мкг альдаровых кислот (молярная масса – 210 г/моль) в 1 мл раствора или 2,33 μмоль/мл. Из 1 моля сахарозы образуется 2 моль альдаровых кислот. Следовательно, в реакцию вступило 1,16 μмоль/мл сахарозы.

Для определения массы фермента использовался метод Лоури.

Опыт проводили в двух повторностях. К 1 мл разведённого в 20 раз фермента добавили 5 мл «реактива С», провели инкубацию в течение 10 минут, добавили 0,5 мл реактива Фолина и оставили при комнатной температуре на 30 минут. При λ=750нм определяли оптическую плотность. Концентрацию белка расчитывали по калибровочной кривой (см. приложение), построенной по стандартным растворам белка. Уравнение кривой – y=0,0018x

Среднее значение оптической плотности составило 0,279 оптических единиц, что составляет 155 мкг белка в мл раствора белка 1:20. Соответственно, в растворе 1:5000 содержится 6,2x10-4 мг/мл фермента.

Итого, удельная активность фермента: пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru .

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.

Для вычисления константы Михаэлиса были проведены ферментативные реакции гидролиза сахарозы в концентрациях от 0,01 до 0,05 моль/л (в трёх повторностях каждой концентрации). Концентрации продуктов были определены по методу ДНСК аналогично предыдущим опытам.

Результаты определения и расчитанные параметры приведены в таблице.

[S], M D470(1) D470(2) D470(3) D470 av. ∆S, M V,mol/l*min E, μmol/(min*mg) 1/V 1/S V/S
0,008 0,359 0,430 0,351 0,380 1,392E-03 1,988E-04 320,72 5028,95 125,00 0,0249
0,016 0,634 0,652 0,650 0,645 2,364E-03 3,377E-04 544,67 2961,26 62,50 0,0211
0,024 0,819 0,790 0,850 0,820 3,002E-03 4,289E-04 691,81 2331,44 41,67 0,0179
0,032 0,999 0,999 1,010 1,003 3,673E-03 5,247E-04 846,26 1905,92 31,25 0,0164
0,04 1,120 1,095 1,021 1,079 3,951E-03 5,645E-04 910,41 1771,63 25,00 0,0141
График зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата, как и предполагалось, имеет вид логарифмической кривой.   пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

Далее, с помощью графика в двойных обратных координатах и графика Иди-Хофсти (см. приложение) были определены константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции.

Km = 0,035 моль/л, Vmax = 0,0011 моль/(мин*л).

Выводы

1. В процессе выполнения работы было определено оптимальное время инкубации фермента с субстратом – 7 минут, оптимальная концентрация субстрата – 0,02 моль/л.

2. Оптимальный pH для работы фермента – 5,2.

3. Изучение термостабильности показало значительное падение активности фермента после прогревания при температуре cвыше 55oC.

4. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции были определены на уровне 0,035 моль/л и 0,0011 моль/(мин*л) соответственно.

Приложение

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента. - student2.ru

Наши рекомендации