Глибинний метод культивування

Поверхневий метод культивування

При поверхневому методі мікроорганізми розвиваються на поверхні твердого зволоженого поживного середовища, частіше це природний матеріал (пшеничні висівки, буряковий жом, кукурудзяні кочережки, та їх суміші). Для деяких спеціальних цілей мікроорганізми вирощують на поверхні розпарених зерен рису, сої та ін. Мікроорганізми потребують відповідних умов: t⁰ O₂, тому середовище рихле, шаром 2—5 см. Цей метод вимагає великих площ і багато ручних операцій.

Його переваги:

1) концентрація ферментів набагато більша (у декілька разів),

2) більша активність ферментів (для гідролізу 100 кг крохмалю необхідно 5 кг поверхневої культури і 100 л глибинної),

3) якщо не потрібне очищення ферментів — легко висушити і транспортувати (це спиртове виробництво, силосування трав),

4) менш енергоємне виробництво.

Найчастіше застосовують пшеничні висівки додаючи наповнювачі (індуктори), такі як солі N, P, солодові ростки, картопляний сік, кукурудзяний екстракт, дріжджовий гідролізат.

Технологічні етапи одержання ферментів поверхневим методом

1.Стерилізація суміші поживного середовища паром (0,2 — 0,3 атм, 45 — 60 хв.) у стерилізаторах. Для кращої стерилізації додають розчини H₂SO₄, HCl або формалін.

2.Тут же проводять зволоження, охолодження до t 38 — 40 °С і засів конідіями чистої культури штаму грибів. Охолодження здійснюють продуванням холодного повітря або кожухом (водою). Засівають сухою культурою спор, або зависсю у воді не відділеною від поживного середовища.

3.Засіяні висівки на спеціальному столі розкладають у простерилізовані кювети, які ставлять на етажерки, і на 36 — 48 год., у деяких випадках 48 — 56 год. направляють їх у камери пророщування, в яких t =30 — 32⁰С, 12% вологості.

4.Далі — подрібнення культури, висушування, упаковка. Забруднення конідіями — основна небезпека виробництва. Тому обладнання, вентиляція герметичні і стерильні.

Якщо необхідно очищати препарат ферментів то подрібнену культуру екстрагують водою і далі проводять операції як і при глибинному культивуванні мікроорганізмів.

Глибинний метод культивування

Механізований, автоматизований процес.

Розробка оптимального складу поживного середовища і співвідношення його складових, вибір найкращого і доступного індуктора— самий основний етап роботи. Джерело вуглецю: крохмаль, різні борошна, жом і дуже рідко — глюкоза, сахароза та ін вуглеводи. Часто проводять попереднє оцукрювання крохмалю, борошна до мальтози (клейстер з борошна). Як джерело органічних азотистих сполук використовують кукурудзяний екстракт, солодовий, дріжджовий автолізат і т. п. + мінеральні солі.

Етапи виробництва:

1. Стерилізація середовища (t 118 — 125 °C, 45 —60 хв.). Охолодження.
2. Посів культури при 30 °С. Посівний матеріал вирощують у посівних ферментерах об’ємом 5 — 10% від виробничих, на оптимальному поживному середовищі.
3. Біосинтез ферментів у глибинних культурах пліснявих грибів протікає 2 — 4 доби при безперервній подачі повітря і перемішуванні. Для гасіння піни застосовується стерильна олеїнова кислота та ін.
4. У випадку екзоферментів міцелій або бактеріальні клітини відділяють фільтруванням. Якщо внутрішньоклітинні ферменти, то проводиться спеціальна обробка. Наприклад, глюкозооксидозу Aspergillus niger виділяють після подрібнення міцелію і дії ферментів, які гідролізують стінки міцелію.

Технологічна схема глибинного культивування мікроорганізмів при виробництві ферментів за своїми принципами не відрізняється від схем виробництва антибіотиків, органічних кислот, амінокислот та ін. продуктів. Відмінні продуценти, поживні середовища, умови культивування. Послідовність операцій і обладнання схожі.

5. ОДЕРЖАННЯ ОЧИЩЕНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

Більша частина гідролітичних ферментів легко видаляється з культури грибів, бактерій так як у клітинах, де закінчились процеси метаболізму, проникаюча здатність оболонки збільшується і ферменти переходять з клітини в навколишнє середовище або воду при екстрагуванні. У виробничих умовах важливо не розбавляти екстракти, не знижувати концентрацію ферментів, тому що багато розчинників буде витрачатись на їх осадження.

Для видалення ферментів застосовують дифузійний метод (використовується у виробництві цукру, олії, гідролізату білків сої).У батареї дифузорів здійснюється протитечія води і відфільтрованої культури (міцелію) так, що концентрація речовин збільшується по мірі руху їх розчину і збирається із завантаженого свіжого матеріалу. Так вилучається 90-95 % ферментів Екстракт не містить нерозчинних домішок. Дифузію проводять водою при t 25-28 ⁰C з додаванням формаліну, фільтром є сама культура. Екстракт – темнозабарвлений розчин, що містить 10-15 % сухих речовин.

Цей розчин можна упарювати у 3-5 разів у вакуум-апаратах, де t кипіння » 30 ⁰С, до концентрації 50-55%. Застосування рідких впарених сиропів розповсюджено для обробки шкіряної сировини, в текстильній промисловості, у виробництві сиру. Також існують способи висушування не упарених і частково упарених розчинів на розпилювальній сушилці. Так одержують сухі технічні препарати. Але для більшості галузей промисловості (харчова, легка, медицина) необхідні більш або менш очищені препарати ферментів.

Самий розповсюджений метод одержання більш очищених препаратів у вигляді порошку – це осадження ферментів органічними розчинниками – етиловим, ізопропіловим спиртами, ацетоном. У водно-спиртових розчинах ферментні білки випадають в осад, тому що зниження діелектричної константи сприяє взаємодії білкових молекул, вони утворюють агрегати і осідають. Осад швидко промивають (2-3 рази) спиртом для видалення води і висушують у центрифузі, вакуум-сушилці. Такі препарати є комплексами різних ферментів. Якщо необхідно розділити, наприклад, амілази і протеази, то використовують різну розчинність фермента у сиртових розчинах різної концентрації. При концентрації спирту 50-52% осідає 90% протеаз, амілази осаджують 76% спиртом.

Другий метод виділення ферменту з розчину – висолювання нейтральними солями (сульфат амонію), воно більш специфічне для білків і тому препарати мають більшу активність ніж при спиртовому осадженні. Фракціонування, виділення посторонніх білків теж відбувається на основі їх різної розчинності у розчинах з різною концентрацією. Недоліком є складнощі з регенерацією (видаленням) солі. Найбільш ефективним способом очистки екстракту є діаліз, при його застосуванні підвищується активність ферментних препаратів.

Більш ефективним методом концентрування ферментів є сорбція їх на іонообмінних смолах або ПАР з подальшою елюцією. Гомогенність виділених препаратів встановлюється декількома методами. Із них найбільш надійні гельфільтрація, електрофорез, ультрацентрифугування. Якщо всі методи підтверджують гомогенність, тоді одержаний індивідуальний ферментний білок.

Для видалення високоочищених і гомогенних препаратів ці методи використовують у різному поєднанні і послідовності. Часто доводиться повторювати прийоми. Іноді застосовують речовини, які утворюють із ферментом нерозчинні сполуки, наприклад, це утворення комплексу –амілази з риванолом (використ. Японія).

6. ІМОБІЛІЗАЦІЯ І СТАБІЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ

Широкі дослідження розпочалися у 60 — 70-х роках коли назріла потреба розробки технологічних стабільних ферментних препаратів. Використанню ферментів на практиці заважали дві обставини. По-перше, ферменти, як правило, гомогенні каталізатори, що дуже незручно з технологічної точки зору, так як каталізатор важко відділяти від продуктів реакції і використовувати повторно. Біотехнологічний процес не може бути неперервним і автоматизованим. По-друге, ферменти досить нестабільні і звичайно не можуть функціонувати достатньо довго. На протязі останніх 20-ти років ці проблеми були вирішені. Перша — шляхом розвитку методів іммобілізації ферментів. Це така процедура у результаті якої молекула ферменту одним із способів прикріплюється до об‘єкта, не розчинного у воді. Після завершення реакції вони легко відділяються з розчину. Проблема стабілізації вирішувалась розвитком таких методів іммобілізації, які одночасно призводили до зміцнення білкової глобули. Також збільшення стабільності ферментів (у 100-1000 р.) досягали шляхом створення особливих умов проведення процесу і застосування хімічної модифікації носія.

Методи іммобілізації

Розрізняють: фізичні (адсорбування ферментів на поверхні матриці і утримання його за рахунок електростатичних сил, гідрофобних, водневих зв‘язків, Ван-дер-Ваальсових взаємодій) та хімічні (утворення ковалентних зв’язків між ферментом і матрицею) методи іммобілізації.

Простий і найбільш старий спосіб іммобілізації полягає в адсорбції ферментів на твердому носії неорганічної (силікагель, оксид Al, активоване вугілля і т. д.) або органічної (іоніти, полісахариди) природи. Неорганічні носії мають хороші механічні властивості. Особливо зручні пористі скло і кераміка. Але їх недолік - значна неспецифічна сорбція побічних речовин і часто недостатньо міцне закріплення ферментів на носії.

Більше розповсюдження отримав інший фізичний метод: включення ферментів в різні полімерні гелі (одержується тривимірна сітка). Тому у випадку високомолекулярних субстратів метод непридатний. Найбільшого розповсюдження набув метод включення ферментів в поліакриламідний гель. Ферменти вводять у розчин акриламіду (СН₂ = СНСОNН₂) і зшиваючого реагенту бісакриламіду (СН₂ = СНСОNНСОСН = СН₂) додають ініціатор полімеризації, наприклад, (NH₄)₂S₂O₈ і одержується гель з іммобілізованим ферментом.

Останній метод фізичної іммобілізації — включення ферменту в мікрокапсули і волокна. Тут фермент залишається у своєму звичному водному середовищі. Крапельки водного розчину ферменту розпилюють в органічному розчиннику і на межі поділу фаз виникає оболонка (мембрана) за рахунок міжфазної полімеризації (або зниження розчинності полімеру, присутнього в одній із фаз). Мембрана мікрокапсули проникна для низькомолекулярних субстратів, але не проникна для ферменту (як і у випадку гелів). Капсули легко відділяються фільтруванням.

Щоб утворились волокна спочатку одержують емульсію водного розчину ферменту в органічному розчиннику, що містить полімер, здатний утворювати волокна (триацетат целюлоза (ТАЦ), нітроцелюлоза, етилцелюлоза). Потім цю емульсію продавлюють через тонкі отвори в інший розчинник, який викликає коагуляцію полімеру. Одержуються волокна, які містять мікрокрапельки водного розчину ферменту.

Суть хімічних методів іммобілізації ферментів полягає в утворенні ковалентних зв’язків між носієм і ферментом. Дуже перспективний метод поєднання ковалентної „зшивки” з включенням в гель.

Ковалентна іммобілізація — найбільш надійний спосіб утримання ферменту на носії. У наш час промисловість випускає носії для ковалентної іммобілізації. Але вартість таких ферментних каталізаторів істотно зростає.

Носії для іммобілізованих ферментів

Носії (матриці) для іммобілізованих ферментів — це частіше всього органічні полімерні матеріали природного або синтетичного походження.

До перших слід віднести такі природні носії як полісахариди (пориста целюлоза, агароза, губчатий крохмаль, глікоген, альгінові кислоти та їх солі, хітин, гепарин та ін.), білки (колаген, кератин, нерозчинні білки — глобуліни бавовнику, казеїн, міозин, фібриноген, фіброїн та ін.), ліпосоми.

Із синтетичних полімерних носіїв слід відмітити матриці виготовлені на основі акрилової кислоти, полівінілового і поліалілового спиртів, поліуретанові полімери, полістироли, нейлон та ін.

Із адсорбентів неорганічної природи частіше всього використовуються синтетичні макропористі кремнеземні матеріали: пористе скло, силікагель, сілохром, а також природні носії, як пісок, глини, ціоліти, активоване вугілля, кераміка з контрольованими розмірами пор, оксиди металів.

Ідеальних носіїв не буває. Так, гранули пористої целюлози по багатьох параметрах переважають сучасні полімерні матеріали (механічна міцність, невисока вартість, реакційна здатність, відсутність неспецифічної взаємодії), але піддається дії мікробів.

Для попередження деяких негативних властивостей носії модифікують. Так, оброблена формальдегідом, гліоксалем або глутаровим альдегідом молекула губчатого крохмалю модифікується за рахунок утворення зшивок і стає стійкою до гідролаз (ферментів що гідролізують полісахариди).

При покритті поверхні кремнеземних сорбентів плівкою оксидів Al, цирконію, гафнію, титану зменшується їх розчинність у лужному середовищі і знищується неспецифічна сорбція.

Найбільш підходящим носієм для ферментів при хімічних методах іммобілізації являється целюлоза та її похідні. Цей полімерний матеріал володіє такими цінними властивостями, як висока гідрофільність та здатність порівняно легко давати широкий спектр похідних у вигляді порошку, гранул або плівок. Доцільно ковалентно з’єднувати ферменти і матрицю не прямо, а через посередник (місток). Молекула цієї сполуки повинна бути невеликого розміру і містити більше однієї реакційноздатної групи. Такими властивостями володіють поліфункціональні реагенти, наприклад: глутаровий альдегід, хлористий ціанур, 2, 4-динітро-3, 5-дифторбензол та ін.

CI

С

N N

N≡N⁺ N⁺≡N

C C

CI N CI SO₃^– SO₃^–

Хлористий ціанур N,N'-бісдіазобензидин-2,2'-дисульфокислота

NO₂

O O

F F C – CH₂ – CH₂ – CH₂ – C

H H

NO₂глутаровий альдегід

2,4-динітро-3,5-дифторбензол

Поліфункціональні сполуки придатні також і для зв’язування молекул ферменту між собою, тут краще інших зарекомендував себе глутаровий альдегід.

Один із основних недоліків цих сполук — їх здатність взаємодіяти з функціональними групами (активним центром), внаслідок чого фермент інактивується. Але застосовують зворотне блокування (захист активного центру) глутатіоном, цистеїном та ін. (якщо він утворений SN-групами) після іммобілізації ферменту. В інших випадках для блокування додають субстрат в насичуючій активний центр ферменту концентрації.

При виборі методу іммобілізації враховують природу каталізованої реакції, механічні властивості і фізичну форму носія. Ідеального методу іммобілізації немає.

Для одержання іммобілізованих ферментів з раніше запланованими параметрами можна також активізувати поверхні, частіше всього модифікованого носія, шляхом переведення, наприклад, NO₂-фукціональних груп в реакційно здатні солі діазонію; СООН–групи карбоксилвмісних матриць послідовною обробкою хлористим тіанолом а потім імідазолом активізуються, перетворюючись в імідозоліди, які набувають здатність взаємодії з різними нуклеофілами (сполуками, що містять аміногрупи).

О O HC = N O HC = N

R – С + SOCI₂ R – C + HN R – C – N

ОН CI HC = CH HC = H

Полімер хлористий імідазол імідазолід

тіанол

Існує велика кількість способів модифікації матриці і активування їх функціональних груп. Від того з якими функціональними групами носія реагує фермент при його іммобілізації залежіть ємність матриці (ємність носія — це маса білка зв’язана одиницею його маси(» 40 - 150 мг на 1 г носія).

Роботи з пошуку нових носіїв для одержання іммобілізованих ферментів йдуть паралельно з вивченням способів зв’язування матриці і ферменту з метою одержання біологічно активних речовин з високим ефектом при їх використанні в біотехнології, медицині, аналітиці, харчовій промисловості.

Розроблений також метод реактивації денатурованих ферментів (відновлення початкової конформації глобули). Якщо денатуровану молекулу розвернути (це досягається дією сильних, але зворотних денатурантів таких як сечовина або гуанідін разом з відновниками типу дитіотреітол, який відновлює зв’язки —S—S— до —SH) а потім дати їй можливість повільно звернутись, забравши денатуранти і замінивши відновник на окиснювач, (звичайно це кисень повітря), то утвориться знову активна молекула.

Іммобілізують не лише виділені ферменти, але і цілі клітини мікроорганізмів. Частіше всього їх включають в поліакриламідний гель або в гель каррагінану (полісахарид з морських водоростей). Розроблений спосіб іммобілізації клітин мікроорганізмів з високою аспартазною активністю шляхом їх включення в гель полісахариду морських водоростей каррагінану. Так біотехнологія одержання L-аспарагінової кислоти з фумарату амонію за допомогою іммобілізованих клітин мікроорганізмів стала без конкуренції.

Переваги цього методу в тому, що процес дешевший, крім того, ферменти в клітинах частіше стабільніші ніж виділені. Недоліком є низька проникаюча можливість клітинних оболонок для субстратів.

Оцінку ефекту стабілізації або дестабілізації проводять порівнянням k_ін. (коефіцієнт інактивації) вихідного і модифікованого (іммобілізованого) ферменту.

k_ін. — швидкість інактивації ферменту на певній стадії (50% або 75%) або враховується час, на протязі якого активність зменшується у два рази (напівперіод життя).

Більш складна проблема стабілізації ферментів. Що призводить до інактивації ферментів? По-перше, як і всі білки, вони можуть бути «з’їдені»мікроорганізмами;

по-друге, може відбуватись міжмолекулярна агрегація білкових молекул, а у випадку гідролітичних ферментів так званий автоліз тобто гідроліз ферментів під їх же дією;

по-третє, молекула ферменту може втратити структуру у результаті порушення бокових груп поліпептидного ланцюга під дією t, рН, органічних розчинників (денатурація). Як правило, білкова глобула при цьому розвертається і переходить у клубок. Активний центр ферменту руйнується;

по-четверте, інактивація може відбуватися за рахунок хімічної модифікації функціональних груп (реакція з домішками).

Перша причина частково знімається при іммобілізації ферментів в пористих носіях (екран від мікроорганізмів). Більш універсальний спосіб — проведення процесу в умовах пастеризації при 70°С (але можлива інактивація). Ставка робиться на ферменти термофільних мікроорганізмів. Також розроблені прийоми стабілізації ферментів в умовах підвищеної t°. Суть більшості з них у тому, що вони штучно закріплюють каталітично активну конформацію ферменту. Для цього обробляють фермент якимось зшиваючим реагентом, наприклад, диальдегідом. Найбільш розповсюджений — глутаровий альдегід (НОС(СН₂)₃СОН). У результаті його взаємодії з аміногрупами ферменту з’являються додаткові зв’язки між ділянками поліпептидів, які перешкоджають розвертанню глобули.

Третій підхід — фермент включають в «тісні» пори носія. Тоді стінки пор перешкоджають розвертанню. У наш час досліджуються термофільні мікроорганізми і виділення з них ферментів. Проведення біотехнологічних процесів при t 60-70 до 110 °C вирішить багато проблем у виробництві різноманітної продукції.

ЯК ПРАЦЮЮТЬ ФЕРМЕНТИ

Швидкість реакцій, які протікають під дією ферментів в 10 млн. разів (min) — 100 тис млрд. разів (max) вища, ніж реакцій, що каталізуються звичайними хімічними каталізаторами. Так, гідроліз складних ефірів N-ацетиламінокислот під дією хімотрипсину проходить в 10⁷ разів швидше ніж під дію такої ж концентрації НCl, а для гідролізу сечовини під дією уреази — в 10¹⁴.

Що зрозуміти у чому справа необхідно уточнити уявлення про хімічні реакції.

Частинки реагують одна з одною, якщо вони володіють достатньою енергією і правильно орієнтовані у просторі при зближуванні. Суть каталізу і полягає в тому, що каталізатор «допомагає» частинкам набути необхідної енергії, або зблизитись і правильно зорієнтуватись.

Хімічні каталізатори в більшості допомагають енергетично. Перевага ферментів у тому, що вони використовують і енергетичні і просторові шляхи прискорення (приклад з гайками і болтами в банці порівняти з руками). Таким чином «молекулярні щипці» — найпростіша форма ферментів.

Що являє собою молекула ферменту і яким чином в його функціях реалізується принцип «молекулярних щипців»? Сьогодні є можливість не лише виділити будь-який фермент в абсолютно чистому вигляді, але і чітко встановити його повну молекулярну структуру в тривимірному зображенні. Для цього використовують метод рентгеноструктурного аналізу.

Було встановлено, що в основі молекули будь-якого ферменту лежить білкова глобула з молекулярною вагою від 10 000 до сотень тисяч дальтон (1Д — вага 1 атома водню), форма близька до еліпсоїда з розмірами 25-200 Ангстрем (1/100 000 000 см). Поліпептидний ланцюг складається з залишків a-амінокислот, які можуть існувати в L і D-формах. У природних білках амінокислоти майже виключно L-форми. До складу білків будь-яких живих організмів на Землі входить 20 природних амінокислот. Вони можуть взаємодіяти між собою, утворюючи пептиди, добре розчинні у воді. Якщо кількість залишків амінокислот велика (n > 50 -100) то поліпептид згортається в глобулу і утворюється білок. Частина білків виконує інші фізіологічні функції і не являється каталізаторами. Наприклад, альбумін, глобулін крові та ін.

У ферментах структура глобули така, що на її поверхні з бокових груп амінокислот формується так званий активний центр. Цей центр захоплює молекули реагуючих речовин, активує їх і орієнтує в просторі тобто виконує функції «молекулярних щипців». Вбудовуватись такі «щипці» можуть лише в молекули певної структури. Цим забезпечується дуже висока специфічність ферментативного каталізу.

ЗАСТОСУВАННЯ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

Протеїнази

Давно застосовуються в харчовій промисловості. Першим ферментом, що застосовується в промисловості була a-амілаза з Aspergillus oryzae, виробництво якої почалось у 1890 р. Препарати рекомендували використовувати, як засіб, що сприяє травленню. Але виробництво обмежене до 60-х років, коли їх стали використовувати у складі детергентів. Про таку можливість було відомо за 50 р. до цього, ще в 1913 р. продавався засіб для замочування білизни, що містив соду і панкреатинові ферменти.

У кінці 60-х років приблизно 50% всіх детергентів у Європі і США уже містили протеази (для їх виробництва використовувалися Bacillus subtilis). Постійно ведеться робота по збільшенню активності ферментів (особливо їх здатності видаляти плями) і стабільності в миючих розчинах.

Ще одна галузь де широко застосовуються протеаз — це виробництво сиру. Тут всі зусилля були направлені на пошук мікробних замінників сичуга телят.

Для виробництва протеаз у промисловому масштабі необхідні штамми мікроорганізмів, які синтезують зовнішньоклітинні протеази з високим виходом. Ці ферменти поділяють сьогодні на три групи: серинові, кислі і металопротеази.

Серед серинових на першому місці — субтилізин За участю Bacillus licheniformis виробляється » 500 т очищеного фермента на рік. Серинові проотеази не гідролізують білки до амінокислот. У пральні порошки додають 0,5% препарату, що містить 3% активного ферменту. Кількість ферменту мала, але він концентрується на плямах білкової природи із-за спорідненості. Менше застосовуються протеази алкалофільних видів Bacillus і вони активні при рН = 9 — 12 і t > 50 °C.

До складу металопротеаз входить атом металу (звичайно Zn), без якого фермент не активний. У промисловості металопротези одержуються за допомогою Bacillus amyloliguefaciens і B. thermoprotealytiсus. Специфічність дії більша ніж у серинових протеаз, але не можна використовувати як «мікробний сичуг» так як рівень неспиціфічного протеолізу в них все ж дуже високий. Вони застосовуються у пивоварінні при гідролізі білків ячменю, так як серинові протеази інгібіруються речовинами солоду. Видалення з їх допомогою білків виключає потемніння пива при охолодженні, яке відбувається у результаті взаємодії білків з танінами. З цією метою використовують протеази рослин папаїн і бромелаін.

Кислі протеази синтезуються грибами. За властивостями вони схожі на травні ферменти тварин пепсин і ренін. Застосовують їх для гідролізу соєвого білка при виробництві соєвого соусу, в хлібопеченні (змінюють клейковину щоб одержати пишні бісквіти), як засіб що сприяє травленню або ж зберігає пиво від потемніння. Специфічність кислих проотеаз термофільних грибів Mucor pusillus і Mucor miehei схожа на ферменти сичуга і широко застосовується для створожування молока (інші надмірно гідролізують казеїн ). Розробляється інший підхід на основі технології рекомбінантних ДНК, проведено клонування і одержана експресія гена реніну телят в мікроорганізмах (наприклад E. coli). Синтезований таким способом фермент успішно пройшов випробування при дослідному виробництві сиру.

Протеази застосовуються і в шкіряній промисловості при видаленні шерсті і пом‘якшенні шкіри, вона стає м’якою і еластичною.

Глюкозоізомераза

«Королевою» іммобілізованих ферментів в промисловості можна вважати глюкозоізомеразу, яка каталізує перетворення глюкози у набагато солодшу фруктозу. Фруктозні сиропи сьогодні широко вживаються в харчовій промисловості. Запатентовано багато способів іммобілізації і використання як самої ізомерази так і клітин що її містять. Процес відбувається при 60 - 65 °С при рН 7,0 - 8,5 в присутності іонів Mg.

Амілази і амілоглюкозидази

Використання ферментів у виробництві крохмалю дозволяє контролювати глибину його гідролізу і одержувати продукцію з бажаними властивостями: густиною, солодким смаком, осматичним тиском, стійкістю до кристалізації. Гідроліз каталізується ферментами 3-х різновидів: ендоамілазами, екзоамілазами і a-1,6-глюкозидазами.

Ендоамілази — це a-амілази, вони розщеплюють a-1,4 глюкозидні зв’язки в амілазі і амілопектині з утворенням олігосахаридів з різною довжиною ланцюга і a-конфігурацією. Для зрідження крохмалю за високої температури використовують термостабільні a-амілази. Так, температурний оптимум у ферменту з Bacillus amyloliguefaciiens при 70 °С, а у амілази В. liheniformic – при 92 °С (може працювати при 110 °С). За цих умов активність ферменту стабілізується іонами Са і високою концентрацією субстрату.

Для зрідження крохмаль диспергують у воді при нагріванні, при охолодженні проводять його частковий гідроліз для зменшення в’язкості і осідання. При одностадійному зрідженні фермент додають на початку до приготування суспензії яке проводять при 150 °С на протязі 5 хв, після чого гідроліз ферментом ведуть 2 години при 95 °С. При кислотно-ферментному зрідженні фермент вносять після драглювання крохмалю, викликаного нагріванням.