Управляемое культивирование. Антибиотикорезистентность и технологические пути ее решения.

Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате - обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста. Процесс непрерывного культивирования - перспективное направление современной биотехнологии. Стерилизация питательных сред Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. Среда должна соответствовать определенным требованиям: а) обеспечивать максимальный выход антибиотика; б) состоять из относительно дешевых компонентов; в) иметь хорошую фильтрующую способность; г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков. Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до температуры 120-130 С непосредственно в ферментаторах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 минут (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27-30 С. За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, уничтожается значительное число микроорганизмов. Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время. Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускают острый пар (давление пара около 50 5 Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Среда, нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (~130 С), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125-130 С. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5-10 минут. Отсюда стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30-35 С (на выходе) и поступает в ферментатор. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и др. Подготовка посевного материала Подготовка посевного материала - одна из ответственейших операций в цикле биотехнологического способа получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментаторе, так и биосинтез антибиотика. Продуцент обычно выращивают на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов.

Подготовка посевного материала - процесс многоступенчатый (рис.5.5).

Рис. 4.5. Схема многоступенчатого приготовления посевного материала А - выращивание во флаконах, Б - в колбах на качалках: 1 - законсервированный исходный материал; 2 - споровая генерация на косом агаре в пробирке; 3 - II споровая генерация на твердой среде в сосуде; 3 а и 3б - I и III генерации на жидкой среде в колбе; 4 - ферментатор предварительного инокулирования; 5 - ферментатор инокулирования; 6 - основной ферментатор

Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирке (1, 2), затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение двух-трех суток для каждой генерации (3а и 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор 5 (100-500 л), откуда и делают посев в основной ферментатор 6. Для посева в основной ферментатор используют от 5 до 10 % посевного материала (инокулята). Развитие продуцента антибиотика в ферментаторах Развитие микроорганизма в ферментаторах проходит при строгом контроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с помощью ЭВМ. Большое внимание при развитии продуцента в ферментаторах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма образуется обильная пена, которая существенно нарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментаторе. Появление большого количества пены обусловлено белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано с обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментаторах используют поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутананкарбамил и др.). Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа). Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и химической очистки представлена на рис. 4.6.

Рис. 4.6. Схема производства антибиотиков: I - приготовление посевного материала; II - инокуляторы для наращивания посевного материала; III - стерилизатор среды для большого ферментатора; IV - установка для биосинтеза антибиотика; а - стерилизация среды в колбах; б - охлаждение и посев культуры продуцента в колбу; в - рост культуры в покое; г - рост культуры в качалке; д - инокулятор со стерильной средой; е - инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента; ж - фильтры и компрессор; з - резервуар со сжатым воздухом; и - нагрев воздуха; к - ферментатор; л - рубашка для охлаждения ферментатора

Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотиков В процессе развития микроорганизмов образуемые им антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость попадает лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то сначала антибиотик переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Цель химической очистки - извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение (собственно, очистка) от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения. В ряде случаев антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенной температуры, высокой кислотности или щелочности и др.) теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности. Основные методы очистки антибиотиков следующие: экстракция, ионообменная сорбция и осаждение. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Антибиотикорезистентность и технологические пути ее решения.

Снижение эффективности антибиотикотерапии при гнойной инфекции обусловлено лекарственной устойчивостью микроорганизмов. Антибиотикорезистентность микроорганизмов обусловлена: 1) длительностью курса проводимой антибиотикотерапии; 2) нерациональным, без должных показаний, применением антибиотиков; 3) применением препарата в малых дозах; 4) краткосрочным курсом антибиотикотерапии. Немалое значение в увеличении устойчивости микроорганизмов к антибиотикам имеет бесконтрольное применением антибиотиков больным, особенно таблетированных препаратов.

Одновременно с ростом антибиотикорезистентности происходит изменение микробного пейзажа. Основным возбудителем гнойной хирургической инфекции стали стафилококки, кишечная палочка, протей. Часто стали встречаться микробные ассоциации. При лечении гнойных процессов, вызванных ассоциациями микроорганизмов, применение антибиотиков представляет теперь трудную задачу, так как если один из штаммов ассоциации устойчив к применяемым антибиотикам, то при лечении будут подавляться чувствительные к ним микроорганизмы, а устойчивые штаммы будут активно размножаться.

Установлено, что скорость развития и степень выраженности антибиотикорезистентности зависят, как от вида антибиотика, так и от микроорганизмов. Поэтому перед проведением антибиотикотерапии необходимо определять чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

В настоящее время наиболее распространенным методом определения чувствительности микробной флоры к антибиотикам является метод бумажных дисков. Этим методом, как наиболее простым, пользуется большинство практических лабораторий. Оценка степени чувствительности микробной флоры к антибиотикам проводится по зонам задержки роста в соответствии с инструкцией по определению чувствительности микробов к антибиотикам, утвержденной Комитетам по антибиотикам в 1955 году.

Однако данный метод имеет очень серьезный недостаток – обычно проходит 2-3 дня, а то и более дней, прежде чем станет известна чувствительность микроорганизма к антибиотику. А это значит, что время для начала применения антибиотикотерапии будет упущено. Вот почему в клинической практике настойчиво ищут способы раннего определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Однако до настоящего времени такой способ еще не разработан. Правда, А.Б.Черномырдик (1980) предложил ориентировочный метод быстрого назначения антибиотиков на основании бактериоскопии отделяемого из гнойной раны. При этом мазки, окрашенные по Грамму, просматривают под микроскопом. По специально разработанной таблице соответственно найденному в препарате микроорганизму выбирают антибактериальный препарат.

Борьба с адаптационной способностью микроорганизмов к антибиотикам, также как и с антибиотикорезистентностью штаммов микроорганизмов, достаточно трудна и проводится по трем направлениям: 1) применение больших доз антибиотиков; 2) изыскание новых антибактериальных препаратов, в том числе и антибиотиков; 3) комбинация антибактериальных препаратов и антибиотиков с различным механизмом действия на микробную клетку, а также сочетание антибиотиков с другими лекарственными препаратами, обладающими специфическим воздействием на антибиотикорезистентность.

Применение больших доз антибиотиков не всегда возможно из-за токсичности некоторых из них. К тому же применение больших доз антибиотиков допустимо лишь при условии наличия чувствительности микроорганизма к данному антибиотику. В повышенных дозах, но не более чем в 2-3 раза превышающих лечебные, можно применять препараты, имеющие минимальную токсичность на организм больного. В то же время, как свидетельствуют данные американских ученых, применение высоких доз антибиотиков не предупреждает образования антибиотикорезистентных форм микроорганизмов.

В нашей стране борьба с резистентностью микроорганизмов к антибиотикам направлена на создание новых антибактериальных препаратов, в том числе и антибиотиков. Кроме того, разрабатываются более рациональные пути введения антибиотиков, для создания высокой их концентрации в организме больного.

Антибиотикорезистентность микроорганизмов может быть преодолена путем комбинированного назначения антибиотиков. При этом необходимо учитывать характер их взаимодействия – недопустимо применять сочетание антибиотиков, которые взаимно уничтожают активность друг друга (антогонизм антибиотиков). Знание возможности взаимодействия антибиотиков позволяет повысить эффективность антибактериальной терапии, избежать осложнений и уменьшить проявление адаптивных свойств микроорганизмов.