Характеристика микробного сообщества почвы

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

Специальность: 012400 (ОКСО 020209) – микробиология

Отчёт

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ

Выполнили:

Студенты 3 курса

Группы 102

Липатникова А.А.

Данилова М.А.

Преподаватели:

Зеленихин П.В.

Мочалова Н.К.

Казань - 2013

ВВЕДЕНИЕ

Почвенные микроорганизмы- совокупность разных групп микроорганизмов, для которых естественной средой обитания служит почва. Почвенные микроорганизмы играют важную роль в круговороте веществ в природе, почвообразовании и формировании плодородия почв. П. м. могут развиваться не только непосредственно в почве, но и в разлагающихся растительных остатках. В почве встречаются также некоторые болезнетворные микробы, водные микроорганизмы и др., которые случайно попадают в почву (при разложении трупов, из желудочно-кишечного тракта животных и человека, с поливной водой или др. путями) и, как правило, быстро в ней погибают. [Виноградский С. Н., Микробиология почвы, М., 1952]

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

Цель работы: охарактеризовать микробное сообщество почвы.

Используемые материалы: пробирки с 9 мл водопроводной воды, колба с 45 мл водопроводной воды, чашки Петри, пипетки с отколотыми концами, среды – МПА, Гаузе, Чапека, Эшби, Гетчинсона (твердые), Гильтея и Виноградского I и II (жидкие).
Ход работы:

Подготовка сред:

1. МПА МПБ, агар – 20 г/л

2. Среда Чапека (г/л), pH 4,2-4,5 :

Компонент: Масса, г:
Сахароза 30,0
NaNO3 2,0
KH2PO4 1,0
MgSO4*7H2O 0,5
KCl 0,5
FeSO4 0,01
CaCO3 3,0
агар-агар 20,0
дист. вода 1000,0
молочная кислота 2 мл/л

3. Среда Гаузе, (г/л) pH=7,2-7,4

Компонент: Масса, г:
крахмал 20,0
K2HPO4 0,5
MgSO4 0,5
KNO3 1,0
NaCl 0,5
FeSO4 00,1
агар-агар 20,0
дист. вода 1000,0

4. Среда Эшби (г/л)

Компонент: Масса, г:
Сахароза, или маннит 20,0
K2HPO4 0,2
MgSO4*7H2O 0,2
KH2PO4 0,1
NaCl 0,2
CaCO3 0,5
агар-агар 20,0
дист. вода 1000,0


5. Среда Гетчинсона (г/л), pH=7,2-7,3:

Компонент: Масса, г:
K2HPO4 1,0
CaCl2*6H2O 0,1
MgSO4*7H2O 0,3
NaCl 0,1
FеCl3*6H2O 0,01
NaNO3 2,5
агар-агар 20,0
дист. вода 1000,0

6. Среда Гильтея (г/л). Готовят два раствора:

Компонент: Масса, г:
I) KNO3 2.1
аспарагин 1.0
дист.вода
II) Лимоннокислый натрий 5.0
KH2PO4 2.0
MgSO4*7H2O 2.0
CaCl2 2.0
FеCl3 0.01
дист.вода

· после растворения солей растворы сливают вместе;

· устанавливают pH 6,8 - 7,0;

· доводят объем до 1000 мл;

· добавляют индикатор (бромтимоловый) синий до появления зеленого цвета;

· среду разливают по 9 мл в пробирки, опускают поплавки для улавливания газов и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.

7. Среда Виноградского (г/л):

Для первой фазы нитрификации: Для второй фазы нитрификации:
Компонент: Масса, г: Компонент: Масса, г:
(NH4)2SO4 2,0 NaNO2 1,0
K2HPO4 1,0 Na2CO3 1,0
MgSO4*7H2O 0,5 NaCl 0,5
NaCl 2,0 K2HPO4 0,5
FeSO4 0,4 MgSO4*7H2O 0,3
CaCO3 5,0 FeSO4 0,4

1)Взвешиваем 5 г почвы (образец № 2), используя стерильный шпатель, и помещаем почву в ступку, предварительно простерилизованную методом фламбирования, наливаем из колбы немного воды, растираем почву пальцем, надев резиновый напальчник, очищаем от посторонних фрагментов и очищенную гомогенную почвенную массу перемещаем обратно в колбу с 45 мл воды (перед этим производим посев на среды Гетчинсона и Эшби, выкладывая кусочки почвы в шахматном порядке). В течение 3 минут круговыми движениями перемешиваем почву.

2)Далее производим ряд разведений – пипеткой переносим 1 мл почвенной вытяжки из колбы в пробирку с 9 мл воды, перемешиваем и переносим 1 мл жидкости в следующую пробирку. Таким образом доводим до разведения 10־⁸.

3)Далее производим посев на среды:

o Глубинный посев на МПА из разведения 10־⁸. Ставим в термостат на 28°С на 72 часа, после чего производим визуальный анализ колоний и микроскопируем препараты «раздавленная капля», «висячая капля» и «фиксированный мазок».

o Посев газоном на Гаузе и Чапека из разведения 10־². Чашки Петри со средой Чапека инкубируют при 24-26°C 3-5 суток, со средой Гаузе – при 28°С 14 суток.

o В среды Гильтея, Виноградского I и Виноградского II вносим 1 мл суспензии из разведения 10־⁴, В среде Гильтея должны находиться стеклянные поплавки или кусочки ваты, после посева среду Гильтея заливаем 0,5-1 мл вазелина для создания анаэробных условий. Инкубируем при температуре 28-35°С, учет изменений производим через 7, 14, 21 дней.

o На теплую, но уже застывшую среду Гетчинсона выкладываем диски из фильтровальной бумаги, после чего на неё и на среду Эшби выкладываем по 25-30 комочков почвы в шахматном порядке, избегаю слишком близкого расположения. Инкубации производится во влажной камере при температуре 28-30° в течение 2-х недель.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

1. Учет бактерий на мясо-пептонном агаре (МПА)

Описание колоний

Размер, см Форма Край Цвет Структура Микроорганизм
0,7 Круглая Ровный Кремовый, бежевый, белое пятно в середине Неоднородная Актиномицет
0,9 Круглая Ровный Розовато- кремовый Однородная Бациллы, короткие палочки средней толщины, собраны в пары, с округлыми краями
0,4 Круглая Неровные, волнистые, округлые Телесно – бежевый Однородная, волокнистая Бациллы, среднего размера, с закругленными краями
1,3 Неровный круг Неровные, обрывистые, волнистые Жемчужно- розовый Посередине однородная, по краям волокнистая, морщинистая Палочки в цепочках, средние, бочковидные, со спорами
1,1 Круглая Ровные Цвет слоновой кости Однородная Бациллы, толстые, крупные, с прозрачными вышедшими спорами
Неровный круг Мелко - зубчатые Бледно - желтый Однородная, слегка зерниста Бациллы со спорами, расположенными ближе к полюсу. Есть тонкие, есть толстые, расположены попарно.
1-0.5 овальная перистый Белый Волоскнистая B. micoides
0.5 округлая неровный волнистый Нежно-розовый Складчатая Очень мелкие палочки
округлая ровный Бледно-голубой Ровная, однородная Микрококки, диплококки
округлая ровный Бледно-белый Вогнутая Средних размеров пачлочки, спор не обнаружено
0.3 округлая ровный Кремово-розовый Выпуклая Сарцины
0.5 округлая ровный Ярко-желтый Скалдчатая, не блестит Небольшие палочки, спор не обнаружено, распологаются поодиночке
округлая неровный волнистый Серовато-белый Складчатая, блестит Палочки со спорами

Количество микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы:

а = б*в*10/г , где:

а - число клеток в микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы;

б - среднее число выросших колоний;

в - соответствующее разведение;

10 -коэффициент пересчета на 1 г почвы;

г - содержание абсолютно сухой почвы на 1 г исходной почвы.

Среднее количество колоний 105.

2. Учет микромицетов на среде Чапека

Воздушный мицелий Субстратный пигмент
Белый Желтый, яркий
желтый желтый

Расчет количества грибных зачатков в почве:

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

а- число грибных зачатков на 1г почвы;

б- среднее кол-во колоний на чашках;

в- разведение;

г- кол-во капельв 1 мл суспензии;

д- вес почвы, взятой на анализ.

Среднее количество колоний 37.

3. Учет актиномицетов на среде Гауза

Колония № Субстратный мицелий Воздушный мицелий Пигмент Микроскопия
Шоколадно - коричневый Бледно - розовый - характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru
Темно-коричневый Белый, чистый - характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru
Темно - зеленый Бежево - коричневый - характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru
Бежево – коричневый Бежево - кремовый - характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

Расчет количества грибных зачатков в почве:
характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

а- число грибных зачатков на 1г почвы, б- среднее кол-во колоний на чашках , в- разведение, г- кол-во капель в 1 мл суспензии, д- вес почвы, взятой на анализ.

Среднее количество колоний 14.

4. Выделение азотобактера методом посева почвенных комочков на агаризованную среду Эшби

Перед микроскопирование делаем окраску по Гимсу:

1.На обезжиренное предметное стекло помещается капля черной туши, в которую вносится культура;

2. Тушь растирается при помощи другого стекла, мазок высушивается и фиксируется в смеси Никифорова в течение 5-10 минут;

3. После производится окраска фуксином цилия (1:3) 2-3 минуты, затем краситель смывается водопроводной водой.

Микроскопируем с иммерсией.

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

На темном фоне малиновые клетки, расположенные попарно, вокруг них находится капсула.

Процент содержания азотобактера (Х):

а – общее кол-во комочков почвы;

в – число комочков с ростом азотобактера.

Х = 100%

5. Определение аэробных целлюлозоразрушающих бактерий в почве методом посева комочков

Тип разрушения целлюлозы: изменение цвета – становится желтой, бурой, коричневой, происходит рост грибов.

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru Микроскопия:

1.

 
  характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru Мицелий без спор.

2. характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

Мицелий, споры Fusarium или Aspergillus.

Процент содержания целлюлозоразрушающих бактерий: 100%.

6. Наблюдение денитрификации и получение накопительной культуры на среде Гильтея

Денитрификация

характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru характеристика микробного сообщества почвы - student2.ru

1. Диссимиляционная денитрификация;

2. Ассимиляционная денитрификация.

Цвет среды Гильтея из зеленого превратился в голубой, что говорит об изменении pH среды, так как в процессе ассимиляционной денитрификации образуется аммоний; в стеклянном колпачке скапливается газ – азот, что говорит о прохождении процесса диссимиляционной денитрификации.

Для определения продуктов жизнедеятельности денитрифицирующих бактерий из культуральной жидкости делают пробы:

1. На нитрат (NO3) с дифениламином;

2. На нитрит (NO2) с цинк-йод-крахмалом или реактивом Грисса;

3. На аммиак (NH3) с реактивом Несслера.

  Дефиниламин + H2SO4 Реактив Грисса Реактив Несслера
7 суток мало нет есть
14 суток нет нет есть
21 суток нет нет есть

Это говорит о том, что в среде процесс денитрификации идет очень быстро, и нитраты быстро восстанавливаются бактериями до аммония и азота.

При микроскопировании (фиксированный препарат) обнаружились мелкие палочки, Pseudomonas.

7. Выделение нитрифицирующих бактерий из среды Виноградского I и II

  Дефиниламин + H2SO4 Реактив Грисса Реактив Несслера
Среда Виноградского I
7 суток нет мало немного
14 суток мало есть есть
21 суток есть есть есть
Среда Виноградского II
7 суток есть есть нет
14 суток есть есть нет
21 суток есть нет нет
                   

Это говорит о том, что процесс нитрификации идет крайне медленно.
При микроскопировании (фиксированный препарат) обнаружились кокки, бациллы: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus, Bacillus.

Наши рекомендации