Методы регистрации в тонкослойной хроматографии.

Вторым важным этапом аналитической тонкослойной хроматографии является количест­венное определение разделенных компонентов пробы. В целом спосо­бы количественного анализа можно разделить на две группы. Первая группа включает способы, предполагающие предварительное извлечение с пластины адсорбента с зоной компонента и последующее определение его количества различными физико-химическими методами. Вторая группа позволяет определить количества вещества непо­средственно на пластине путем:

· графического измерения (или визуальной оценки) размера пятна
(площади или длины зоны);

· с помощью инструментальных методов — сканирование пласти­ны детектирующей системой.

Среди последней группы методов можно выделить:

· оптические (отражение, пропускание, отражение-пропускание,
флуориметрия, гашение флуоресценции);

· ядерно-физические (авторадиография, сцинтилляция — в этом случае проводят денситометрию не самой пластины, а контактных отпечатков с нее на фото- или рентгеновскую пленку);

· электрохимические (полярография, кондуктометрия);

· применение детекторов для газовой хроматографии и др.

Рассмотрим некоторые из приведенных методов более подробно.

К первой группе относятся методы экстракции пятен. Пластинку с пятном вещества помещают под УФ-лампу (длина волны излучения — 254 нм), и пятно обводят по периметру мягким карандашом. Сорбент в преде­лах отмеченной области извлекают шпателем и при помощи воронки пере­носят в центрифужную пробирку. Добавляют точный объем растворителя, тщательно перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость пе­реносят пипеткой в кювету и проводят фотометрические измерения.

Более точные результаты получаются путем прямого элюирования с пластинки. В этом случае биопробу наносят в виде сплошной линии, затем пластинку проявляют; а хроматограмму помещают под УФ-лампу (длина волны излучения 254 или 360 нм). Зоны обводят мягким карандашом. Уча­сток пластинки, несколько больший, чем зона выделенного вещества, вы­резают и элюируют в специальном растворителе (элюент стекает сверху вниз непосредственно по слою сорбента). Полученный элюат можно ана­лизировать подходящим методом (фотометрия, микротитрование, поляро­графия и т. п.). При таком варианте нанесения биопробы удается провести разделение в пределах нескольких миллиграммов, а этого количества дос­таточно для применения спектрофотометрического анализа.

Ко второй группе относятся графические методы, основанные на из­мерении размеров и других параметров пятна, характеризующих форму (геометрию) хроматографических зон, непосредственно на пластинке.

Метод сравнения (качественный). Готовят серию стандартных растворов различной концентрации (например, 1, 2, 4, 8 мг/мл), кото­рые наносят с определенными интервалами на пластинку (по 2 мкл). В промежутки между ними наносят биопробу, разведенную до опреде­ленной концентрации. После проявления хроматограммы сравнивают интенсивность окраски и размеры пятен и на этом основании оценива­ют концентрацию анализируемого вещества.

Метод определения размеров пятен (эмпирический). Для одина­ковых размеров стартовых пятен в пределах определенных величин существует линейная зависимость:

S = nlgq + р, где S — площадь пятна; q — масса вещества; n, р — константы, опре­деляемые из калибровочных графиков (формула справедлива только при небольшой разнице в количестве вещества в исследуемых зонах).

Однако из-за несовершенного детектирования границ пятна эта за­висимость не всегда выполняется. Поэтому количественная оценка мо­жет быть проведена только прямым сравнением с серией эталонных растворов, которые наносят на одну пластину с исследуемыми проба­ми. Строят графическую зависимость в координатах {S, lgq} по эта­лонным образцам, определяют площадь пятна анализируемой пробы и по калибровочному графику находят количество вещества в пятне. Оп­ределение площади пятна проводят следующим образом: после прояв­ления на пластинку помещают лист прозрачной миллиметровой бума­ги и определяют площадь пятна в квадратных миллиметрах. Погреш­ность метода составляет 4—10 %. Она может быть уменьшена путем усреднения результатов многократных замеров и при использовании технических средств анализа изображений.

Часто используют также метод внутреннего стандарта, при кото­ром готовят три раствора:

· с неизвестной концентрацией определяемого компонента (раствор 1);

· разбавленный в одиннадцать раз раствор 1 (раствор 2);

· раствор 2 с добавлением определенного количества эталона (раствор 3).

Затем эти растворы в равных объемах наносят на пластинку и по­сле проведения тонкослойной хроматографии определяют по формуле количество неизвест­ного компонента.

Сканирующие методы.Для количественной оценки результатов используют денситометр, по возможности, в блоке с ЭВМ. Обычно пластинку сканируют в про­дольном направлении (рис.5) узким пучком излучения, вытянутым параллельно стартовой линии, геометрические размеры которой опре­деляются размерами диафрагмы. Длина волны источника излучения должна соответствовать области поглощения анализируемых веществ. По длине пучок излучения должен быть сопоставим с размерами ска­нируемых пятен. Результаты сканирования более стабильны, если дли­на щели меньше диаметра пятна.

Рис.5. Сканирование пластинок тонкослойной хроматографии: а — вид пластинки сверху; б — хроматограмма, полученная на выходе денситометра.