Определение гидролизуемости тканей рыбы под действием собственного комплекса протеолитических ферментов

Свежую или размороженную рыбу (5-10 экземпляров, в зависимости от размеров) разделать на тушку, аккуратно отделить внутренние органы, тщательно зачистить брюшную полость, отделить мышечную ткань от костей и кожи.

Пищеварительные органы (желудок, пилорические придатки, кишечник, печень) освободить от остатков пищи, ожирков, гонад. Промыть водой, подсушить на марле или фильтровальной бумаге.

Мышечную ткань и отдельно пищеварительные органы взвесить на технических весах с точностью до 0,05 г. Определить соотношение массы и пищеварительных органов, полученных при разделке рыбы. С учетом полученного соотношения рассчитать, какая масса пищеварительных органов (М) приходится на 20 г мышечной ткани.

Мясо рыбы пропустить два раза через мясорубку и хорошо перемешать. Внутренние органы как можно мельче разрезать ножом или ножницами и растереть в ступке. Измельченные ткани (фарш и пищеварительные органы) положить раздельно в два бюкса с крышкой и палочкой для взятия навесок.

В шесть стаканчиков по 50 мл взять навески по 20 г мышечной ткани (фарша) и М₂ пищеварительных органов с точностью до 0,05 г (в каждый стаканчик).

Если при определении соотношения массы мышц и пищеварительных органов получилось 10:1, то в этом случае навеску внутренностей взять в количестве 2 г.

Навески тканей количественно (без потерь) перенести с помощью 50 мл буферного раствора с заданным рН в мерные колбы на 200 мл, распределив их согласно данной таблице.

Маркировка колб	Навеска, г	рН
Фарша	Пищеваритель- ных органов	Буферного раствора	Смеси
1 К	20,0	М (или 2 г)	7,0	6,7
1 Т	20,0	М -«-	7,0	6,7
2 К	20,0	М-«-	10,0	8,0
2 Т	20,0	М-«-	10,0	8,0
3 К	20,0	М-«-	1,8	3,1
3 Т	20,0	М-«-	1,8	3,1

Для ускорения работы в колбы 3К и 3Т можно взять навески по 20 г фарша и проводить опыт при рН смеси 6,7.

Все колбы встряхивают на механической мешалке в течение 15 мин. После этого в каждую колбу добавляют по 1 мл толуола в качестве антисептика. Затем контрольные образцы с индексом «К» помещают в кипящую водяную баню на 10 мин для инактивации ферментов. После прогрева на водяной бане контрольные образцы (колбы с маркировкой 1 К, 2 К и 3 К) используют для определения начального содержания азота конечных аминогрупп (N_ам) методом формольного титрования.

Колбы с активным комплексом ферментов (1 Т, 2 Т и 3 Т) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37^оС в течение 1,5-2,0 часов

После термостатирования колбы 1 Т, 2 Т и 3 Т помещают в кипящую водяную баню на 10 мин и инактивируют ферменты так же, как и в контрольных пробах. При определении активности комплексов протеиназ в кислой среде (колба 3 Т) при плохой коагуляции белка можно добавить 1 н раствора едкого натра в количестве 10% к массе содержимого.

После нагревания колбы охлаждают под струей водопроводной воды, доводят до метки дистиллированной водой (до 200 мл) тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в чистые и сухие конические колбы.

В фильтратах как контрольных, так и опытных проб определяют формольно-титруемый азот. В коническую колбу на 100 мл приливают 25 мл фильтрата, добавляют 5 капель фенолфталеина и осторожно по каплям нейтрализуют 0,1 н раствором едкого натра до слабого розового окрашивания. При избытке раствора щелочи пробу вначале оттитровывают 0,1 н раствором соляной кислоты.

К нейтрализованному фильтрату добавляют 10 мл 37-40%-ного раствора формалина, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину. После перемешивания содержимое колбы титруют 0,1 н раствором едкого натра.

Для определения кислотности формалина проводят холостой опыт. В коническую колбу приливают 25 мл дистиллированной воды, 10 мл формалина и титруют в присутствии фенолфталеина до слабо-розового окрашивания.

Азот конечных аминогрупп (мг/г) вычисляют по формуле:

,

где: V₁ - количество 0,1 н раствора щелочи, израсходованной на титрование в рабочей пробе после добавления формалина, мл;

V₂ - количество щелочи, пошедшей на титрование в холостой пробе, мл;

V₃ - объем мерной колбы, мл;

V₄ - объем фильтрата, взятый для титрования, мл;

К - коэффициент нормальности раствора щелочи;

1,4 - количество аминного азота, соответствующее 1 мл точно 0,1 н раствора едкого натра, мг;

m - масса навески (фарша и внутренностей), г.

Количество аминного азота (конечных аминогрупп) в пробах до (N_{ам к}) и после термостатирования (N_{ам Т}) определить как среднее из трех параллельных результатов титрования.

Рассчитать активность комплексов протеиназ в кислой среде, щелочной среде и при естественном значении рН (6,7) по приросту азота конечных аминогрупп за 1 час гидролиза на 1 г мышечной ткани:

АКП = , мг N_ам /г*час

АКП = , ед/г*час

По результатам экспериментов, проведенных студентами всей группы составить сводную таблицу и сделать выводы об активности комплекса протеиназ (АКП) различных видов рыб в зависимости от рН среды.