Обнаружение капсул по методу бурри
1. Смешать на предметном стекле немного культуры и каплю туши, разведенной 1:10 (рис. № 6)
2. Ребром шлифовального стекла сделать тонкий мазок, также как мазок крови: каплю туши наносят на предметное стекло на расстояние одной трети от левого края. В эту каплю бак. петлей вносят культуру. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45О, прикасаются к капле туши с культурой. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Мазок заканчивается «метелочкой»
3. Сбросить шлифовальное стекло в дез. средство
4. Высушить на воздухе
5. Бактериоскопировать (рис. № 7)
ОБНАРУЖЕНИЕ КАПСУЛ ПО МЕТОДУ БУРРИ-ГИНСА
1. Приготовить мазок на предметном стекле по методу Бурри
2. Высушить на воздухе
3. Фиксировать химическим способом: погружение стекла в емкость со спиртом или сулемой – 10 мин, или со смесью Никифорова (спирт и эфир 1:1) – 15-20 мин
4. Осторожно промыть водой
5. На мазок нанести фуксин Пфейффера – 3-5 мин
6. Промыть Н2О
7. Высушить на воздухе
8. Микроскопия с иммерсией.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Препарат по Бурри – Гинсу под микроскопом: фон черный, клетки бактерий красные, капсулы неокрашенные (красители не воспринимают) (рис. № 8).
Рис. №7. Окраска по Бурри и Бурри-Гинсу
Рис. №8. Капсула у Klebsiella pneumoniae
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №4
Выявление спор по методу Ожешко.
Студент должен знать:
- классификацию микроорганизмов,
- строение, состав и значение спор,
- процесс спорообразования,
- примеры споровых микробов,
- классификация бактерий по расположению спор,
- методы выявления спор,
- особенности окраски по методу Ожешко, красители и реактивы
- цель применения и сущность метода,
- цель обработки препарата кислотами.
Студент должен уметь:
- выявление спор у бактерий методом Ожешко,
-микроскопия окрашенных препаратов с использованием иммерсионной системы,
- соблюдение мер безопасной работы с живыми культурами микробов,
- обработка рабочего места и рук дез. веществами.
Этапы самостоятельной аудиторной работы:
9. Подготовить препарат из культуры и окрасить его по методу Ожешко
10. Препараты, подготовленные и демонстрационные, промикроскопировать с иммерсией
11. Обработать рабочие места и руки
12. Зарисовать результаты микроскопирования и записать алгоритм метода в дневник
ОКРАСКА ПО МЕТОДУ ОЖЕШКО
1. На высушенный мазок (нефиксированный!) + несколько капель 0,5% НCl, держать над пламенем спиртовки до образования паров
2. Высушивают и фиксируют физическим способом
3. Окрашивают по методу Циля-Нильсена:
1) На фиксированный препарат + фильтровальная бумага + фуксин Циля. Подогреваем до отхождения паров + краситель (2 раза)
2) Н2О
3) 5% Н2SО4 (погружая 2-3 раза)
4) Н2О
5) Метиленовый синий 1 % - 3-5 мин
6) Н2О
4. Микроскопия с иммерсией
Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители.
Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка в голубой цвет (рис. № 9).
Рис. №9. Споры у Bacillus subtilis
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №5
Определение подвижности микроорганизмов
методами нативных препаратов.
Студент должен знать:
- строение, состав и значение жгутиков,
- классификация бактерий по расположению жгутиков,
- примеры жгутиковых микробов,
- факторы, влияющие на скорость движения микробов,
- методы определения подвижности микробов,
- особенности темнопольной микроскопии,
- принцип строения влажной камеры, ее предназначение,
- особенности культур, используемых в данных методах.
Студент должен уметь:
- техника микроскопии нативных неокрашенных препаратов в темном поле,
- выявление подвижности микроорганизмов,
- методика приготовления висячей капли,
- методика приготовления раздавленной капли,
- соблюдение мер безопасной работы с живыми культурами микробов,
- обработка рабочего места и рук дез. веществами.
Этапы самостоятельной аудиторной работы:
13. Подготовить препараты висячая и раздавленная капли из культуры, выращенной на жидкой питательной среде
14. Препараты бактериоскопировать в темнопольной микроскопии
15. Обработать рабочие места и руки
16. Записать результаты микроскопирования и алгоритмы методов в дневник
МЕТОД РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ
1. На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. !Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
2. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
3. Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
МЕТОД ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ
1. 
Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло, вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина (рис. № 10)
2. На покровное стекло наносят каплю культуры и осторожно накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре
3. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время
Микроскопия сначала при увеличении 8Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40Х (рис. № 11).
Рис. №10. Техника приготовления препарата висячая капля
| Рис. №11. Лептоспира в темном поле |
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Зачетное занятие с замером навыков по теме:
«Морфология микроорганизмов»
Перечень манипуляций к зачету:
- подготовить препарат и окрасить его по методу Грама. Значение метода
- подготовить препарат и окрасить его по методу Ожешко. Значение метода
- подготовить препарат и окрасить его по методу Бурри-Гинса. Значение метода
- подготовить препарат, окрасив его по методу Циля-Нильсена (1999г). Значение метода
- подготовить препарат висячая капля, значение методики
- подготовить препарат раздавленная капля, значение методики
- промикроскопировать готовые препараты, окрашенные различными методами: по Граму, Ожешко, Бурри-Гинсу, Циля-Нильсену.
Вопросы к зачету:
- назовите основные формы бактериальных клеток,
-перечислите основные и дополнительные структуры прокариотической клетки, их функции,
- укажите состав и строение жгутиков, группы бактерий по расположению жгутиков,
- назовите строение и функции нуклеоида у прокариот,
- укажите, что собой представляет спора и ее значение для бактерий, расположение спор в клетке (примеры микробов).
Тестовые задания для самоконтроля
1. Расставьте этапы приготовления препарата в нужном порядке:
а) окрашивание
б) фиксация
в) приготовление мазка
г) высушивание
2. Укажите соответствие между возбудителем и методом его окраски:
1) стафилококк а) по Граму
2) микобактерия туберкулеза б) Циля - Нильсену
3) пневмококк в) Бурри - Гинсу
4) бацилла сибирской язвы г) Ожешко
3. Простой метод окраски:
а) по Нейссеру
б) метиленовым синим
в) по Граму
г) по Романовскому - Гимзе
4. Хранителем наследственной информации у прокариот является:
а) нуклеоид
б) спора
в) включения
г) капсула
5. Окраска по методу Бурри отличается от метода Бурри-Гинса:
а) по времени окрашивания
б) отсутствия фуксина Пфейффера
в) разные разведения туши
г) мазок фиксируется в пламени горелки
6. При окраске препарата методом Циля-Нильсена (инструкция 1999г.) используется:
а) 0,5% НС1
б) 0,9% NaCl
в) 5% Н2SО4
г) 25% Н2SО4
7. К спорообразованию способны:
а) стафилококки
б) бациллы
в) сарцины
г) кишечная палочка
8. В методике окраски по Бурри-Гинсу используется черная тушь, разведенная в
а) 2 раза
б) 5 раз
в) 10 раз
г) 100 раз
9. Укажите соответствие:
Метод окраски: Цель метода:
1. метод Ожешко а) обнаружение капсулы
2. метод Бурри б) определение кислотоустойчивости
3. метод Циля-Нильсена в) отношение к Граму
4. метод Грама г) определение споры
10. При изучении подвижности используется микроскопия:
а) фазово-контрастная
б) темнопольная
в) электронная
г) люминисцентная
11. Гонококки - это шаровидные бактерии, в мазках выглядят как:
а) диплококки
б) сарцины
в) микрококки
г) тетракокки
12. При окраске по Граму используется следующий краситель:
а) фуксин Циля
б) метиленовый синий
в) бриллиантовый зеленый
г) генциановый фиолетовый
13. Спору у бактерий можно выявить, окрасив препарат:
а) метиленовым синим
б) методом Ожешко
в) методом Грама
г) по Бурри-Гинсу
14. Флагеллин - это белок, входящий в состав:
а) оболочки
б) капсулы
в) цитоплазмы
г) жгутиков
15. Укажите соответствие:
Вид микроскопии: Цель применения:
1) Световая обычная микроскопия а) для изучения живых неокрашенных
препаратов
2)Фазово-контрастная микроскопия б) для изучения окрашенных препаратов
16. Перетрихи - имеют следующее расположение жгутиков на клетке:
а) по всей поверхности
б) на обоих концах
в) пучок на одном из концов
г) один жгутик на конце клетки
17. Виды фиксации:
1) физический а) пламя горелки, б) смесь Никифорова,
2) химический в) ацетон, г) спирт
18. Предметное стекло с лункой используется:
а) в методе Циля-Нильсена
б) изучение подвижности
в) изучения на наличие капсулы
г) при обнаружении споры
19. Дополнительной структурой бактерий является:
а) нуклеоид
б) ЦПМ
в) капсула
г) рибосомы
20. Препарат из нативного материала готовится при окраске:
а) Грама
б) Бурри - Гинса
в) Ожешко
г) Циля-Нильсена
21. Бактерии штопорообразной формы называют:
а) спирохеты
б) спириллы
в) вибрионы
г) бруцеллы
22. Негативные методы окраски используются при методе:
а) Бурри-Гинса
б) Циля-Нильсена
г) Ожешко
д) Нейссера
23. В состав клеточной стенки бактерий входит:
а) крахмал
б) муреин
в) альбумин
г) пилин
24. Методы изучения микроорганизмов:
а) серологические
б) бактериологические
в) аллергические
г) все ответы верны
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
1. в, г, б, а
2. 1 – а
2 – б
3 – в
4 - г
3. б
4. а
5. б
6. г
7. б
8. в
9. 1 – г
2 – а
3 – б
4 – в
10. б
11. а
12. г
13. б
14. г
15. 1- б
2 –а
16. а
17. 1- а
2 – б, в, г
18. б
19. в
20. г
21. а
22. а
23. б
24. г
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2003 г.
2. Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. М., «Медицина», 1976
3. Микробиология /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986 г.
4. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебник / А.А.Воробьев, Ю.С. Кривошеин, А.С. Быков и др. Под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001 г.
5. Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. – Ростов н/Д: Феникс, 2002 г.
6. Руководство для малого практикума по микробиологии, П.А.Чиров, З.И.Остроухова, Е.И.Тихомирова, Изд-во СГУ, 1998 г.
7. Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник для средних медицинских учебных заведений / В.Б. Сбойчаков. – СПб.: СпецЛит, 2007г.
ПРИЛОЖЕНИЕ №1
Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии
Правила работы со спиртовкой
1. Заправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля
2. При зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т.к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта
3. Нельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т.к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт
4. Нельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком.
5. Необходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва
6. При длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками
7. Не следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т.к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание
Правила пользования ручным химическим пенным огнетушителем
ОХП -10
В случае возникновения пожара необходимо:
1. Для приведения огнетушителя в действие – ручку верхней части корпуса поворачивают на 180о и переворачивают огнетушитель вверх дном
2. Струю пены следует направлять не в центр пламени, а под минимальным углом к поверхности горения в нижнюю часть пламени, последовательно сбивая и оттесняя его от краев к центру
3. При тушении огня ОХП – 10 необходимо обесточить все помещения с помощью рубильника, т.к. химическая пена в составе огнетушителя обладает высокой электропроводностью