Окраска производных клеток

Приготовление гистологического препарата для

Световой микроскопии.

1. Взятие материала и фиксация	Из соответствующего органа вырезают небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см) и погружают их в фиксатор (формалин, этанол), обычно на 24 ч. Фиксация производится для предупреждения процессов аутолиза (самопереваривания) тканей. Это достигается путём денатурации (коагуляции) белков. После фиксации образцы промывают проточной водой в течение нескольких часов. (Кусочки органа погружают в специальные кассеты).
2. Обезвоживание и уплотнение материала	Затем образцы уплотняют, чтобы в последующем их можно было резать на микротоме (часто в качестве уплотнителя используют парафин или целлоидин). Предварительно образцы обезвоживают (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань). Для этого их «проводят» по батарее спиртов 70 % , 80 % , 96 % , 100 % этанол по 24 часа в каждом спирте. Так как, парафин не растворим и в этаноле, образцы выдерживают потом в смеси этанол-ксилол и в чистом ксилоле. Заливка: помещают образцы в смесь ксилол-парафин и затем в жидкий парафин на 1-2 ч при 52-56 о С (в термостате). Дают парафину, остывая, затвердеть; вырезают из него блок с заключённым образцом.
3. Приготовление срезов	Кассеты (или кубики) вставляют в специальный прибор - микротом, служащий для приготовления срезов. С помощью микрометрической механической системы объектодержатель вместе с кассетой перемещается за каждый шаг на определённое расстояние (например, 10 мкм). А микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины. Срезы помещают на поверхность тёплой воды для их расправления, а затем – на предметное стекло.
4. Окрашивание срезов	Перед окрашиванием образцы освобождают от парафина (депарафинизация), проводя по батарее растворителей: ксилол, спирт 100 %, 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, вода (по 2-5 мин) Для окрашивания предметные стёкла со срезами помещают на короткое время в раствор красителя, промывают водой, обрабатывают раствором другого красителя (если таковой используется тоже) и вновь промывают водой. Препарат опять обезвоживают (проводя по батарее спиртов с возрастающей концентрацией), а затем просветляют (в карбол-ксилоле и ксилоле) для удаления лишней краски. Наконец, на препарат наносят каплю канадского бальзама (в случае среза) или кедрового масла (на мазки крови) и накрывают покровным стеклом.

Типы гистологических красителей.

Тип красителя	Пример	Окрашиваемые структуры
Кислые красители	Кислоты и кислые соли: v эозин; v кислый фуксин.	а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители	Основные соли: v гематоксилин (точнее, продукт его окисления – гематеин); v азур 2 v кармин.	а) Красящиеся структуры – базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами: ü ядра, ü рибосомы, ü аморфный компонент межклеточного вещества.
Нейтральные красители	Смесь двух красителей: v основного (азур 2) и v кислого (эозин).	а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; например, специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
Индиф- ферентные красители	v судан III, v судан IV	Суданом окрашиваются жировые капли клеток (в которых он растворяется).

Общие методы окраски.

1. Окраска гематоксилин-эозином	1. а) Самый распространённый метод окраски. б) Сочетает основной и кислый красители. в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. 2. Ядра приобретают сине-фиолетовый цвет, цитоплазма – желтовато-розовыйцвет. 3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
2. Окраска железным гематоксилином (по методу Генденгайна)	1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железоаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются: · структуры ядра, · границы клеток, · мышечные волокна.

Окраска производных клеток.

окраска по методу ван Гизона	а) Краситель – смесь растворов пикриновой кислоты и кислого фуксина. б) Коллагеновые волокна (содержащиеся в межклеточном веществе соединительной ткани) окрашиваются в ярко-красный цвет, а элементы других тканей (например, мышечные волокна) – в жёлтый цвет.
окраска по методу Маллори	1. Краситель является трёхцветным: это смесь кислого фуксина, анилинового синего, оранжевого G, а также двух кислот. 2. а) Коллагеновые волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-синий цвет; б) многие другие структуры (ядра, мышечные волокна, эритроциты) – в оранжевый или красный цвет.
импрегнация солями серебром	1. Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем восстановителями. В итоге, выделяющееся серебро осаждается на определённых волокнах соединительной ткани: · Ретикулярные (аргирофильные) волокна приобретают чёрныйцвет, · коллагеновые волокна -коричневый, · ядра клеток - светло-коричневый.
окраска орсеином	· Эластические волокнасоединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет · остальные структуры – в слабо-розовыйцвет.
окраска гематоксилин - пикрофуксином	· Эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в жёлтый цвет, · коллагеновые волокна - в красныйцвет, · ядра клеток - окрашиваются гематоксилином в тёмно-фиолетовый цвет.
окраска по методу Шморля	1. Используется для окраски костей и дентина (зуб). 2. а) Предварительно кусочки материала подвергают декальцинации (с помощью кислоты), а затем выдерживают в растворе алюмокалиевых квасцов. б) Краситель – раствор тионина. 3. а) Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет; б) остальной фон – светло-коричневый.