Окончательный диагноз на основе обнаружения и идентификации вирусов в организме больных животных.
Окончательный диагноз на вирусную болезнь в большинстве случаев может быть поставлен только с учетом результатов лабораторных исследований. В лабораторной диагностике вирусных болезней точность дианоза прежде всего зависит от правильности взятия материала (пробы) от больных и павших животных, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вирусного материала.
Материал для исследования следует брать как можно быстрее после проявления четких признаков болезни или не позднее 1-2 ч. после клинической смерти или убоя (позже начинается бактериальное обсеменение, и по мере продолжения инфекционного процесса количества вируса может уменьшаться в результате воздействия защитным механизмов организма). При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза предполагаемй инфекции ( входные ворота, пути распространения вируса в организме, места его размножения, клинические признаки и пути выделения). В лабораторию направляют тот материал , который с наибольшей вероятностью может содержать возбудителей болезни. При этом необходимо соблюдать следующие общие правила:
материал должен быть взят строго асептически
материал должен быть немедленно законсервирован ( помещен в термос с охлаждающей смесью или добавлением 50-%- ного стерильного глицерина), чтобы предотвратить разрушение вирусов;
материал удобнее брать в стерильные пробирки с резиновой пробкой или во флакончики из под антибиотиков. Для исследования вполне достаточно 5-10 г. материала;
на пробиркак должна быть не смываемая этикетка;
материал направляют с нарочным и сопроводительным письмом, в котором указываю хозяйство, вид больных животных, предварительный диагноз, вид и количество патологического материала, на что следует провести исследование, дату и фамилию врача.
В зависимости от симптомов болезни, а значит, и локализации возбудителя от больного животного может быть взят следующий материал:
смывы со слизистой оболочки носа, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клаоки у птиц. Берут их стерильными ватными тампонами, которые погружают в пробирки или флаконы, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости ( раствор Хенкса, среды Игла, 199 и др.) с антибиотиками;
содержимое везикул, пустул, стенки везикул, корочки на коже;
фекальные массы непосредственно из прямой кишки;
кровь на выделение вируса и кровь для получения парных сывороток крови для обнаружения и определения титра антител.
Для этой цели кровь берут дважды у одного и того же животного - в начале болезни и через 2-3 нед, т.е. в начале и в концце болезни.
От трупов патологический материал должен быть взят не пожзднее 1-2 ч после клинической смерти или убоя животного.В качестве патологического материала берут кусочки органов, которые:
имеют выдимые отклонения от нормы;
могут быть поражены и содержать вирус на основании клинической картины болезни;
наиболее часто содержат вирус: селезенка, печень, легкие, почки, головной мозг, лимфатические узлы.
В лаборатории часть материала берут для исследования, оставшуюся часть хранят на случай дополнительных исследований. Затем составляют план исследования присланного материала, которые включапет следующие задачи:
· обнаружение ( индикация) вируса в материале;
выделение ( изоляция) вируса из материала;
идентификация выделенного вируса;
при необходимости требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса;
ретроспективная диагностика.
Методы обнаружения вирусов в материале от больных животных и трупов. Для обнаружения вируса чаще всего используют экспресс-методы, которые позволяют в материале:
обнаружить вирусные белки (антигены), для этой цели используют серологические реакции: РИФ, ИФА, РНГА, РСК, РДП;
обнаружить вирусные нуклеиновые кислоты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или ДНК-зонда;
обнаружить вирионы вирусов. Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирусы любых размеров, а крупные вирусы (вирусы оспы) можно увидеть под световым микроскопом. Этот метод называется вирусоскопия.
Электроная микроскопия используется в основном в исследовательских целях. Электронный микроскоп - сложный и дорогой прибор, в диагностических ветеринарных лабораториях его нет. Хотя исследование с его помощью-очень эффективный экспресс-метод при диагностике рота-, коронавирусных и других инфекций. Если в материале содержится не менее 10-7 вирионов на 1мл, он не требует дополнительных методов очистки концентрации;
4. Обнаружить тельца - включения под световым или люминесцентным микроскопом.
Тельца-включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках при репродукции в них некоторых вирусов. По природе они представляют собой либо скопления (колонии) вирионов, либо измененный под депйствием вируса клеточный материал, либо комбинацию первого со вторым. Тельца-включения могут находиться в цитоплазме ( чаще это РНК- содержащие вирусы) или в ядре (чаще это ДНК-содержащие вирусы, кроме вируса оспы), или в цитоплазме и ядре клетки (вирус чумы собак). Тельца-включения, образуемые некоторыми вирусами, получили специальное название, так, тельца-включения при оспе кур называются тельцами Боллингера, при чуме плотоядных - Ленца, при бешенстве Бебеша-Негри и др. При обнаружении телец Бебеша-Негри в мазках головного мозга погибшего животного наличие бешенства считается доказанным. При других вирусных инфекциях обнаружение телец-включений имеет лишь вспомогательное диагностическое значение;
5. обнаружить вирусные гемагглютинины, которые являются белками некоторых вирусов (орто-, парамиксовирусов и др).
Гемагглютинирующие вирусы способны аггютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температуры и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале ;
6. для обнаружения вируса в активной форме (инфекционной) используют довольно длительные вирусологические исследования. С этой целью применяют метод биопробы на живых чувствительных к предполагаемому вирусу системах: лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток. В редких случаях приходится использовать естественно восприимчивых животных.