Количественное определение каталазы

Ход определения. Разведенную кровь (1:1000) взбалтывают, наливают по 1 мл в две колбы (или в два стаканчика), приливают 7 мл дистиллированной воды; в опытную пробу добавляют 2 мл 1% раствора перекиси водорода, в контрольную – 5 мл 10% раствора серной кислоты. Действие каталазы в кислой среде (контрольная проба) прекращается, так как она действует при pH=7,4. Колбы оставляют в комнатной температуре на 30 минут. Затем приливают в опытную пробу 5 мл 10% раствора серной кислоты, а в контрольную – 2 мл 1% раствора перекиси водорода. Содержимое каждой колбы титруют 0,1н раствора перманганата калия до появления розовой окраски. Рассчитывают каталазное число (КЧ) по формуле: КЧ = (А-В) × 1,7,где А – количество 0,1н раствора перманганата калия, пошедшее на титрование контрольной пробы, мл; В – количество 0,1н раствора перманганата калия, пошедшее на титрование опытной работы, мл. На титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора перманганата калия, чем на титрование опытной пробы. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой пробы. В норме КЧ колеблется от 10 до 15 единиц.

Клинико-диагностическое значение. Определение активности каталазы имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях содержание каталазы в крови снижается.

К методическим рекомендациям

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ

НА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЯХ

Раздел II. Биоэнергетика. Обмен углеводов.

Тема 2.4. Глюконеогенез. Гликогенолиз. Гликогенез.

Выделение гликогена из печени.

Принцип метода. Гликоген представляет собой белый порошок, хорошо растворяющийся в воде с образованием коллоидного раствора. Гликоген, подобно белкам, обладает резко выраженными гидрофильными свойствами, поэтому его можно легко осадить из растворов при высаливании солями щелочных и щелочно-земельных металлов, солями тяжелых металлов, спиртом. В печени человека при нормальном питании запасается 80-120 г гликогена. При голодании в течении суток почти весь запас гликогена расходуется и его не удается обнаружить обычными качественными реакциями. Метод основан на том, что гликоген хорошо растворим в воде и достаточно устойчив в слабокислой среде. Поэтому метод выделения гликогена сводится к механическому разрушению ткани и экстракции гликогена 5%-ным раствором ТХУ. Основная масса белков при процедуре денатурирует и их легко удалить из раствора фильтрованием.

Ход определения.1. В опыте используют печень сытого и голодавшего животных. Печень забитых животных быстро извлекают, разрезают на тонкие пласты и немедленно опускают в стаканы с кипящим физиологическим раствором для инактивации фермента фосфорилазы гликогена, очень активно разрушающего гликоген. Через 10-15 минут печень извлекают из раствора. Дальнейшее исследование печени сытого и голодавшего животного проводится параллельно.

2. Отвешивают на весах 0,5 г печени, помещают в ступку, заливают 3 мл 5%-ного раствора ТХУ и растирают пестиком в течение 10 мин. Затем к экстракту прибавляют 3 мл дистиллированной воды, суспензию перемешивают и фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.

3. С полученными фильтратами выполняют качественные реакции на гликоген

а) В одну пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, во вторую и третью пробирку – по 1 мл фильтратов. После этого в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли раствора Люголя и сравнивают окраску.

б) В три пробирки наливают по 10 капель фильтрата, полученного из печени сытого животного, и проделывают реакции осаждения. Для этого в первую пробирку приливают 10 капель этилового спирта, во вторую – 10 капель 10%-ного раствора ацетата свинца, в третью насыпают порошок сульфата аммония до полного насыщения (т.е. до тех пор, пока на дне пробирки останутся не растворяющиеся кристаллы соли). Наблюдают: выпадает ли осадок

Оформление работы. Внесите результаты в таблицу: сравните результаты, полученные с печенью сытого и голодавшего животного.

Форма записи

Препарат	Реактивы
спирт	раствор ацетата свинца	сульфат аммония
Печень сытого животного Печень голодавшего животного Выводы