Тема: Возбудители холеры, ботулизма. Патогенные хеликобактерии.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Знать теоретический материал по теме занятия.

2. Освоить лабораторную диагностику хеликобактерной инфекции методом ИФА и ПЦР.

3. Знать биопрепараты для диагностики и профилактики холеры.

4. Промикроскопировать демонстрационные препараты и правильно их зарисовать.

5. Научиться решать ситуационные задачи по теме занятия.

ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Возбудители ботулизма: таксономия, свойства, резистентность.

2. Факторы патогенности, механизм действия ботулотоксинов, патогенез ботулизма.

3. Лабораторная диагностика ботулизма. Профилактика и лечение.

4. Вибрионы – возбудители холеры, свойства, резистентность.

5. Факторы патогенности холерных вибрионов. Механизм действия токсина, генетический контроль токсинообразования. Патогенез холеры.

6. Лабораторная диагностика холеры. Профилактика и лечение.

7. Хеликобактерии: таксономия, свойства, факторы патогенности, роль в развитии язвенной болезни и рака желудка.

8. Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции. Профилактика и лечение.

9. Биопрепараты: ботулинические антитоксические сыворотки, агглютинирующая холерная О₁-сыворотка, холерная вакцина, холерные фаги «С» и Эль-Тор.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Лекционный материал.

2. Учебник «Медицинская микробиология» под редакцией проф. Д.К. Новикова, проф. И.И. Генералова, 2003, стр. 186-188, 237-243, 281-282.

3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр. 127-131, 143-145.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:

1. Лабораторная диагностика хеликобактерной инфекции:

а) ПЦР;

б) Постановка ИФА для серологической диагностики инфекции H. Pylori:

Реагенты

1) Иммуносорбент – планшет полистироловый с адсорбированными на поверхности лунок антигеном CagA Helicobacter pylori.

2) Исследуемые сыворотки.

3) Положительный контрольный образец сыворотки (К+), содержащий антитела к антигену CagA Helicobacter pylori.

4) Отрицательный контрольный образец сыворотки (К–), не содержащий специфических антител.

5) Конъюгат – антитела против IgG человека, меченые пероксидазой хрена.

6) Субстратный буферный раствор, содержащий пероксид водорода.

7) Раствор хромогена тетраметилбензидина (ТМБ).

8) Стоп-реагент – раствор 2M серной кислоты.

Проведение анализа

1) Внесение исследуемых и контрольных образцов.

В лунки планшета, например, А-1 и А-2, В-1 и В-2, С-1 и С-2 и т.д 1 внести по 100 мкл разведенных исследуемых сывороток в дублях. Предварительное разведение сывороток – 1/100.

Внесение контрольных образцов:

100 мкл (К–) в лунки А-11 и A-12;

100 мкл (К+) в лунки В-11 и В-12.

2) Инкубация 30 мин при 37°С в термостате.

3) По окончании инкубации содержимое лунок тщательно аспирировать в сосуд с дезинфицирующим раствором. Промыть планшет 5 раз

4) Внести во все лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 37°С.

5) По окончании второй инкубации удалить содержимое лунок и промыть планшет 5 раз.

6) Внести во все лунки по 100 мкл рабочего раствора хромогена тетраметилбензидина и инкубировать в темноте в течение 30 мин при температуре 18–25°С.

7) Внести во все лунки по 100 мкл стоп-реагента.

8) Измерить оптическую плотность на многоканальном фотометре при 450 нм с фоновой длиной волны 620–650 нм.

Расчеты и оценка результатов

1) Рассчитать среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с отрицательным контрольным образцом.

2) На основании полученных данных вычислить «точку отсечения» – критическое значение оптической плотности (ОПкрит) по формуле:

ОПкрит = ОП(К–) + 0,05.

3) Среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контрольным образцом не должно превышать 0,2 ед. опт. плотн. при использовании двухволнового режима измерения.

4) Среднее значение оптической плотности в лунках с положительным контрольным образцом должно быть не менее 1,0 ед. опт. плотн. При фотометрии.

5) Результат анализа считают положительным, если оптическая плотность образца больше ОПкрит.

6) Результат анализа считают отрицательным если оптическая плотность образца меньше ОПкрит.

7) Проводят протоколирование работы и делают заключение.

Таблица. Результаты серологической диагностики хеликобактерной инфекции методом ИФА.