Механизмы развития устойчивости микробов к антибиотикам.
Помимо побочного действия антибиотиков на макроорганизм человека, антибиотики оказывают нежелательное воздействие и на микроорганизмы: 1) изменяются свойства микробов, что затрудняет их распознавание и диагностику заболеваний; 2) формируется приобретенная антибиотикоустойчивость (резистентность). Различают также врожденную или видовую устойчивость к антибиотикам. Она обусловлена видовыми свойствами, которые определяются геномом клетки (пенициллин не действует на микроорганизмы, у которых отсутствует пептидогликан в клеточной стенке). Циркуляция в природе антибиотикорезистентных бактерий создает трудности в лечении инфекционных заболеваний.
Для того, чтобы антибиотик оказал свое действие на микроорганизм необходимо следующее:
1) антибиотик должен проникнуть в клетку;
2) антибиотик должен вступить во взаимодействие с «мишенью» (структура, на которую должен действовать антибиотик, например, молекула ДНК или рибосомы клетки);
3) антибиотик должен сохранять свою активную структуру.
Если какое-либо из этих условий не будет выполнено, антибиотик не сможет оказать свое воздействие и у бактерий или других микробов развивается устойчивость к данному антибиотику.
Развитие устойчивости объясняется генетическими процессами, что затем проявляется через определенные биохимические механизмы. Например, устойчивость грибов р. Candida к нистатину связана с мутацией генов, которые отвечают за строение клеточной мембраны, которая является «мишенью» для действия нистатина.
Генетические процессы связаны с изменениями в геноме бактерий в результате мутаций и с наличием R-плазмид. В связи с этим различают:
1) хромосомную устойчивость- возникает в результате мутаций в геноме (хромосоме) и обычно бывает к одному антибиотику; такая устойчивость может передаваться по наследству при всех видах генетического обмена;
2) внехромосомную устойчивость (наблюдается значительно чаще) - связана с наличием в цитоплазме бактерий R–плазмиды, которая определяет множественную лекарственную устойчивостью (к нескольким антибиотикам); она может передаваться другим бактериям при конъюгации и трансформации.
Биохимические механизмы:
1) изменение проницаемости мембраны для антибиотика; например, снижение проницаемости наружной мембраны у грамотрицательных бактерий обеспечивает их устойчивость к ампициллину;
2) изменение «мишени»; например, устойчивость к стрептомицину связана с изменением рибосомального белка, с которым взаимодействует стрептомицин;
3) нарушение специфического транспорта антибиотика в бактериальную клетку; например, устойчивость к тетрациклину может быть связана с подавлением транспорта этого антибиотика в клетку;
4) превращение активной формы антибиотика в неактивную (основной биохимический механизм) при помощи ферментов; образование таких ферментов связано с R-плазмидами и транспозонами (отрезками ДНК). Важное значение имеют ферменты пептидазы, которые вызывают гидролиз антибиотиков. Например, ферменты лактамазы, разрушающие b–лактамное кольцо. К этим ферментам относится индуцибельный фермент пенициллиназа. 98% стафилококков образуют пенициллиназу, разрушающую пенициллин, поэтому они обладают устойчивостью к пенициллину. У E.coli и протея пенициллиназа является конститутивным ферментом, чем и объясняется их естественная резистентность к пенициллину. E. сoli образует фермент стрептомициназу, которая разрушает стрептомицин. Имеются бактерии, образующие ферменты, которые вызывают ацетилирование, фосфорилирование и другие изменения структуры антибиотиков, что приводит к потере их активности;
5) возникновение у микробов другого пути метаболизма вместо того пути, который нарушен антибиотиком.
Распространениюантибиотикорезистентности способствуютследующие условия:
1) широкое бесконтрольное применение антибиотиков для лечения (самолечение) и профилактики заболеваний, что способствует отбору резистентных форм, возникших в результате генетических процессов;
2) применение одних и тех же антибиотиков для лечения человека и животных (или в качестве консервантов пищевых продуктов).
Для предупреждения развития устойчивости к антибиотикам и для правильного лечения необходимо соблюдать следующие принципы.
1. Микробиологический: антибиотики применять по показаниям, предварительно определять антибиотикограмму.
2. Фармакологический: при назначении антибиотика необходимо определить правильную дозировку препарата, схему лечения, по возможности сочетать различные средства, чтобы предупреждать формирование резистентных форм.
3. Клинический: учитывать общее состояние больных, возраст, пол, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания, наличие беременности.
4. Эпидемиологический: знать, к каким антибиотикам устойчивы микроорганизмы в среде, окружающей больного (отделение, больница, географический регион).
5. Фармацевтический: необходимо учитывать срок годности, условия хранения препарата, так как при длительном и неправильном хранении образуются токсические продукты деградации антибиотика.
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
Так как одним из важнейших принципов правильного лечения инфекционных заболеваний является выбор антибиотика, к которому возбудитель наиболее чувствителен, перед назначением антибиотиков проводится определение чувствительности возбудителя заболевания к антибиотикам, т.е. устанавливается антибиотикограмма.
Наиболее известны 3 метода:
1. Метод бумажных дисков на питательном агаре. В чашку Петри на питательный агар делают посев микробной взвеси. Избыток жидкости удаляют пипеткой. После впитывания взвеси в агар на засеянную поверхность пинцетом наносят 5-6 разных бумажных дисков с антибиотиками, диски отличаются по цвету. Чашки с дисками ставят в термостат при 37°С на 18-20 часов. Антибиотики из дисков диффундируют в агар. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры судят о ее чувствительности к антибиотикам. Этот метод нельзя применять, если антибиотики плохо диффундируют в агар. Преимущество метода – можно определить чувствительность исследуемой бактериальной культуры сразу к нескольким антибиотикам.
2. Метод серийных разведений в МПБ. Готовят основной раствор антибиотика в соответствующем растворителе. Из основного раствора готовят последующие 2-хкратные разведения в бульоне. Обычно берут 12 пробирок по 1 мл МПБ в пробирке. После последовательных разведений антибиотика в МПБ, в каждую пробирку добавляют 0,1 мл взвеси клеток испытуемой бактериальной культуры, содержащей 106-107 клеток. Посевы инкубируют в термостате 18-24 ч. Результаты отмечают по наличию роста. Если есть рост бактерий – среда мутная. Если нет роста бактерий – среда прозрачная. Если среда в пробирке мутная, то в данной концентрации антибиотик не действует, если прозрачная– антибиотик действует. По последней пробирке с прозрачной средой определяют минимальную ингибирующую дозу антибиотика. Одновременно ставят контрольные пробы: 1-ый контроль (контроль бактериальной культуры) - 1 мл МПБ + взвесь бактерий без антибиотика, 2-ой контроль (контроль антибиотика) - 1 мл МПБ + антибиотик, но без взвеси бактерий. В контрольных пробирках должны быть следующие результаты: 1-ый контроль – помутнение среды (есть рост); 2-ой контроль – среда прозрачная (нет роста). Для того, чтобы узнать какое действие оказал антибиотик (бактерицидное или бактериостатическое), петлей делают посевы из пробирок на сектора ПА. Роста нет – бактерицидное действие, рост есть – бактериостатическое действие. Преимущество метода – определение минимальной концентрации антибиотика, которая ингибирует (подавляет) рост бактериальной культуры.
3. Метод «канавки»(предложен А. Флемингом). Берут чашку Петри с питательным агаром. В центре по диаметру вырезают полоску агара шириной 1 см. Затем канавку заполняют агаром, смешанным с антибиотиком. После застывания канавки перпендикулярно делают посев исследуемых культур (4-5). После инкубации в термостате чувствительность определяют по длине зоны задержки роста, чем она больше, тем культура чувствительнее и наоборот. Преимущество метода – можно определить чувствительность сразу нескольких культур к данному антибиотику.