Цитоплазматическая цАМФ является основным регулятором абсорбции и секреции

Секреция и абсорбция солей — регулируемые процессы, и их нарушение при­водит к диарее. Цитоплазматическая циклическая АМФ (цАМФ) является основ­ным фактором в их регуляции. Механизмы, приводящие к повышению концентра­ции цАМФ в цитоплазме, как правило, усиливают секрецию и снижают абсорбцию солей, приводя к суммарному увеличению секреции. Для понимания этих процес­сов необходимо описать регулируемые транспортные механизмы (каналы и транс­портеры) и компоненты клеточных систем, связанные с цАМФ.

На Рис. 5-7 представлен вторичный мессенджер сигнальной системы (цАМФ), характерный для большинства клеток. Некоторые агонисты, стимулы и фармакологические препараты активируют эту систему, влияя на синтез цАМФ, разруше­ние цАМФ или на оба этих процесса. Активирующий стимул может взаимодей­ствовать с регуляторным G-белком либо прямо, либо через рецепторы, повышая активность аденилатциклазы, что приводит к увеличению синтеза цАМФ из АТФ. Молекула цАМФ связывается в цитоплазме с регуляторными субъединицами другого фермента (протеинкиназы А), вызывая отщепление активной каталити­ческой субъединицы, которая может катализировать перенос фосфата на клеточ­ные белки.

Наиболее важным механизмом в регуляции внутриклеточных процессов яв­ляется фосфорилирование, которое имеет значение для транспорта электролитов и воды в кишечнике, в частности в секреторных клетках кишечных крипт. Как по­казано на Рис. 5-6, любое трансцеллюлярное перемещение Cl^– (как поступление хлора через базолатеральные, так и выход хлора через апикальные участки мемб­раны) регулируется реакцией фосфорилирования. Фосфорилирование апикального Сl^–-селективного канала увеличивает время открытия этого канала, а фосфорили­рование Na⁺,K⁺, 2Cl^–-тpaнcпopтнoгo белка усиливает активность этого процесса. Таким образом, любой стимул, увеличивающий содержание в клетке цАМФ, мо­жет вызвать резкое усиление активной секреции Cl^–.

Роль цАМФ в механизме абсорбции до конца не изучена, хотя есть убедитель­ные данные, говорящие за то, что повышение концентрации цитоплазматической цАМФ уменьшает абсорбцию солей, вероятно, угнетая абсорбцию Na⁺ и Cl^– на апи­кальном участке мембраны. Суммарный секреторный эффект при повышении кон­центрации цАМФ усиливается, поскольку, с одной стороны, происходит увеличе­ние секреции, с другой — уменьшение абсорбции. Нет данных о влиянии цАМФ на активность котранспортера Na⁺ и глюкозы апикального участка мембраны. Поэто­му такой путь поступления Na⁺ в клетку не подавляется даже в случае сильной стимуляции, приводящей к значительному повышению секреции Cl^–. Это объяс­няет эффективность регидратации пероральным приемом растворов глюкозы при лечении диареи.

Циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) также является важным мессенд­жером в регуляции секреции Cl^–. Он образуется под действием гуанилатциклазы и активирует киназу, известную как протеинкиназа G. Циклический ГМФ, как и цАМФ, усиливает секрецию солей, а также ослабляет абсорбцию, хотя тонкие мо­лекулярные основы этих изменений еще менее изучены. Следующим внутрикле­точным мессенджером является кальций, который также модулирует абсорбцию и секрецию, хотя механизмы этого действия тоже пока мало изучены.

Cl^–-канал апикального участка мембраны является трансмембранным регулятором, "сопровождающим" муковисцидоз

В последние годы резко возрос интерес к белку, функционирующему в каче­стве хлорного канала в апикальных участках мембраны секреторных клеток тон­кой кишки, поскольку при врожденном заболевании — муковисцидозе (кистозном фиброзе) обнаружена мутация гена, кодирующего именно этот белок. Ген кодиру­ет белок , состоящий из 1480 аминокислот и названный муковисцидозным транс­мембранным регулятором (cystyc fibrosis transmembrane conductance regulator [CFTR]), который действует в качестве Cl^–-селективного ионного канала. Он ак­тивируется цАМФ и имеется в клетках поджелудочной железы, кишечника, дыха­тельных путей, половых органов. Мутация этого гена приводит к нарушению сек­реции Cl^–, что является причиной многих симптомов при муковисцидозе. Наруше­ние транспорта Cl^– может быть прямым следствием дисфункции CFTR Cl^–-канала. Мутация может приводить: (1) к образованию неполной цепочки белка, кото­рый быстро разрушается в клетке, (2) к синтезу белка с нормальной длиной цепоч­ки, но не встраивающегося в апикальный участок мембраны, (3) к синтезу белка с полной (нормальной) длиной цепочки, но функционально дефектного, который встраивается в апикальный участок мембраны. Наиболее частая мутация — это потеря фенилаланина в положении 508 (ДР508), приводящая к образованию це­почки белка с почти полной длиной, не встраивающейся в мембрану клетки.

Молекулярные механизмы активации CFTR были изучены при анализе его аминокислотного состава (см. Рис. 5-8). Большой цитоплазматический домен (R-домен) содержит много участков, подвергающихся фосфорилированию проте

Рис.5-7. Схема действия вторичного мессенджера сигнальной системы (цАМФ), обнаруженного в большинстве клеток. Связывание гормона (или нейротрансмиттера) с его рецептором образует акти­вированный комплекс, взаимодействующий со стимулирующим G-белком (G;)

Рис.5-7 (продолжение). Активированный G-белок освобождается от гуанозиндифосфата (ГДФ), с ко­торым он связан в неактивированном состоянии, и соединяется с гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Это приводит к образованию С;д и Gp у-субъединиц, после чего Gsa связывается с аденилатциклазой, кото­рая катализирует образование цАМФ из АТФ. Циклическая АМФ образует связи с регуляторными субъединицами протеинкиназы А, от которой отсоединяются каталитические субъединицы, регулиру­ющие фосфорилирование соответствующих участков белков. (По: DarnellJ., Lodish H., Baltimore D. Molecular Cell Biology, 2nd ed. New York Scientific American Books, W. H. Freeman, 1990.)

Рис.5-8. Вероятное строение CFTR. Белок состоит из 1480 аминокислот, образующих около пяти доменов: два мембранно-соединенных домена (MSD1 и MSD2), каждый из которых содержит шесть сегментов, организованных таким образом, что формируют хлорный канал; и три цитоплазматических домена (NBF-1, NBF-2 и R), регулирующих активность канала

инкиназой А (ПКА). Было установлено, что удаление этих участков снижает ак­тивность хлорных каналов при повышении концентрации цитоплазматической цАМФ. Эти каналы имеют также два других цитоплазматических регуляторных домена, которые называются нуклеотидсвязывающими, так как они почти гомоло­гичны семейству белков, связывающих и гидролизующих АТФ. Повышение кон­центрации цАМФ в цитоплазме активирует CFTR следующим образом: цАМФ связывается с каталитической субъединицей протеинкиназы А и освобождает ак­тивную каталитическую субъединицу, которая способствует фосфорилированию одной или нескольких сериновых структур R-домена CFTR. Затем нуклеотидсвязывающие участки присоединяют и гидролизуют АТФ, что в результате открыва­ет каналы. Затраты энергии при этом необходимы для изменения конформацион­ной структуры канала, что ведет к его открытию, после чего происходит пассивный транспорт ионов и затрат АТФ для этого процесса не требуется.

В секреторных клетках кишечника CFTR является единственным хлорным каналом, в то время как в секреторных клетках других тканей (дыхательные пути и слюнные железы) имеется еще и кальцийзависимый Сl^–-канал в апикальном уча­стке мембраны. Поэтому у больных с муковисцидозом эпителий кишечника не спо­собен секретировать Сl^–. Исследования распределения матричной РНК, прове­денные с помощью гибридизации клеток показали, что информация для синтеза CFTR реализуется в клетках крипт кишки, где и происходят секреторные про­цессы.