Раздел i. строение и свойства белков

ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ

ПРИ РАБОТЕ В ЛАБОРАТОРИЯХ

1. К работе в лабораториях допускаются студенты, прошедшие инструктаж по работе с реактивами и биопсийными материалами.

2. В лабораториях кафедры разрешается работать только в халате с длинными рукавами. Длинные волосы должны быть подобраны.

3. Все процедуры при выполнении работ по приготовлению препаратов, отмериванию реактивов (их переливание) должны проводиться только на своём рабочем месте на столе (или в вытяжном шкафу). Нагревание реактивов открытым огнём производится в специально оборудованном вытяжном шкафу. Запрещается проводить какие-либо манипуляции с реактивами над полом.

4. Необходимо соблюдать большую осторожность при работе с крепкими кислотами и щелочами (10% и выше). Особая аккуратность и осторожность необходимы при работе с концентрированными кислотами и щелочами, а также с другими агрессивными веществами (уксусный ангидрид, фенол, пергидроль и др.). Запрещается отмеривать такие реактивы путём подсасывания их ртом во избежание химического ожога полости рта. Отмеривание таких реактивов необходимо производить с помощью сифона или пипетки. Следует остерегаться попадания указанных реактивов на кожу (ожоги) и на одежду (разъедание тканей). Работу с этими веществами следует проводить в резиновых перчатках. При разбавлении крепких кислот для предупреждения разбрызгивания следует добавлять кислоту в воду, а не наоборот.

5. Пролитую щелочь надо засыпать песком или опилками. Затем песок или опилки убрать и это место залить сильно разбавленной кислотой (соляной, уксусной).

Пролитую кислоту следует засыпать песком (опилками нельзя), затем песок убрать лопатой и засыпать содой, потом удалить соду и промыть это место большим количеством воды (в резиновых перчатках).

6. При нагревании пробирок в пламени горелки возможно бурное вскипание и выброс содержимого на расстояние до 2-3 м, что особенно опасно в случае попадания кипящих брызг в лицо и глаза. Для предупреждения подобных случаев нагревание пробирок следует проводить у мениска жидкости, а не у дна, непрерывно вращая их и периодически вынимая из пламени. Надо следить, чтобы отверстие пробирки не было направлено на себя или на кого-нибудь из находящихся в лаборатории. Нельзя закрывать горячий раствор пробкой до полного остывания.

7. При сжигании (минерализации) органических веществ в колбах Къельдаля, при гидролизе белка, при анализе мочи, при работе с фенолом, уксусным ангидридом, хлористым бензолом, нитробензолом, анилином и другими подобными веществами в воздухе накапливаются раздражающие пары. Все указанные работы необходимо проводить в вытяжном шкафу.

9. Нельзя оставлять без присмотра горящие спиртовки. Запрещается держать вблизи открытого огня вату, марлю, спирт и другие легко воспламеняющиеся вещества.

10. При работе с центрифугой необходимо плотно закрывать крышку и запирать её на замок. Увеличивать скорость вращения можно лишь постепенно. Открывать крышку разрешается только после полной остановки ротора.

11. К работе на электромедицинской аппаратуре допускаются лица, изучившие инструкцию по безопасным приёмам работы, приложенную к аппарату.

Запрещается работать на аппаратуре, имеющей электрический пробой, нарушенную проводку, не имеющую заземления (кроме гальванической доски и низковольтной аппаратуры - 24-вольтовой сети).

При прекращении подачи электрического тока необходимо выключить все электроприборы.

12. Все вопросы по технике безопасности, возникающие в процессе работы, следует немедленно выяснить у преподавателя или лаборанта.

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ

I. Теоретическая часть.

I.1.Контроль исходного уровня знаний.

I.2.Обсуждение основных вопросов темы.

I.3.Тестовый контроль.

II. Практическая часть.

II.1.Выполнение лабораторных работ.

II.2.Самостоятельная работа с методическим

материалом.

II.3.Оформление результатов работы.

III. Заключительная часть.

III.1.Анализ полученных результатов.

III.2.Индивидуальный отчет по лабораторной работе.

III.3.Задание к следующему занятию.

III.4.Индивидуальная работа преподавателя со

студентами.

МАТЕРИАЛ ДЛЯ САМОПОДГОТОВКИ

I. ЛИТЕРАТУРА

а) обязательная

1. Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин //Биологическая химия. М.: Медицина, 2002.

б) дополнительная

1. Т.Л.Алейникова, Г.В.Рубцова, Н.А.Павлова //Руковод-ство к практическим занятиям по биохимии.М.:Медицина, 2000.-126с.

2. Биохимия. //Под ред. Е.С.Северина. М.,Геотар-мед, 2003.-779с.

3. Горбунова В.Н., Баранов В.С. //Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С.-Петербург:«Спец. лит-ра», 1997.-286с.

4. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. //Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. С.-Петербург:«Питер», 1999.-505с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. //Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000.-470с.

6. Крю Ж. // Биохимия. Медицинские и биохимические аспекты. М.: Медицина, 1979.

7. Ленинджер А. //Основы биохимии. М.: Мир, 1985.- т.I - III.

8. Марри Р. и др. //Биохимия человека. М.: Мир, 1993.-тт.I, II.

9. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //Под ред.С.Херрингтона и Дж.Макги.М.: Мир, 1999.-560с.

10. Мецлер Д. //Биохимия. М.: Мир, 1980.- тт.I - III.

11. Николаев А.Я. //Биологическая химия. М.:Высшая школа, 1998.

12. Пустовалова Л.М.//Практикум по биохимии. Ростов на Дону: Изд-во Феникс, 1999.-544с.

13. Сборник тестов и задач по биохимии. //Под ред. акад. И.П.Ашмарина. М.: Изд-во МГУ, 1996.234с.

14. Страйер Л. //Биохимия. М.: Мир, 1984.-тт.I - III.

15. Строев Е.А. //Биологическая химия. М.: Высшая школа,1989.

16. Уайт А. и др. //Основы биохимии. М.: Мир, 1981.-тт.I - III.

17. Щербак И.Г. //Биологическая химия. С-Пб.: Изд-во СПбГМУ, 2005.-480с.

18. Элементы патологической физиологии и биохимии. //Под ред акад. И.П.Ашмарина. М.:Изд-во МГУ, 1997. – 237с.

19. Эллиот В., Эллиот Д. //Биохимия и молекулярная биология. М.:Изд-во НИИ Биомед.химии РАМН, 1999.-373с.

II. КОНСПЕКТЫ ЛЕКЦИЙ

III. МЕТОДИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ: тематические папки,

таблицы, плакаты и пр.

КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЗНАНИЙ СТУДЕНТОВ

Студенту выставляется оценка:

ОТЛИЧНО - при глубоком знании программного материала, продемонстрированном: а) исчерпывающим ответом;

б) грамотным свободным владением теорией при решении логических задач и практических заданий; в) знакомством с дополнительной литературой.

ХОРОШО - при твердом знании и грамотном изложении программного материала, отсутствии существенных неточностей в ответе, правильном применении теоретических положений в решении практических вопросов и задач.

УДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при знании только основных положений программного материала и недостаточном усвоении его деталей, характеризующимся неточностями формулировок, недостаточно грамотным и последовательным ответом, затруднением в решении задач.

НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНО - при отсутствии знаний по значительной части программного материала, при существенных ошибках в ответе, неумении использовать теоретический материал при решении логических задач.

Ч А С Т Ь П Е Р В А Я

ОБЩИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ

ПРОЦЕССЫ В ЖИВЫХ ОРГАНИЗМАХ

Занятие № 1

ТЕМА.БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ФИЗИКО-ХИМИ-

ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ

И ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

Цель занятия:

1.Повторить физико-химические и изучить биологические

свойства белков.

2.Ознакомиться с методикой выделения белков.

3.Усвоить принцип разделения белков на фракции методом

высаливания.

Исходный уровень знаний:

- кислоты и основания в органической химии;

- химические свойства карбоксильной группы;

- механизм нуклеофильного замещения у тригонального ато-ма углерода;

- химические свойства аминогруппы: основность и нуклео-

фильность;

- строение, амфотерность и растворимость аминокислот;

- коллоидные растворы и их свойства.

Содержание занятия.

I.2. Элементарный состав белков.

Классификация и номенклатура аминокислот, входящих в состав белков.

Функции белков.

Характерные физико-химические свойства белков.

Методы выделения и очистки белков.

II.1. Работа: ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Высаливание - это осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH4)2 SO4 и др.

Принцип метода.

Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется определенная концентрация одних и тех же солей. При высаливании белок обычно не теряет своих нативных свойств. Он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковую смесь на фракции, а именно: белки сыворотки крови - на альбумины (А) и глобулины (Г). Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, высаливаются в полунасыщенном (50%), а альбумины - в насыщенном (100%) растворе сернокислого аммония.

Хлористый натрий осаждает глобулины при полном насыщении (100%) раствора, а для осаждения альбуминов требуется еще и его подкисление.

Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка опять может раствориться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.

Для определения белка в растворе используется универсальная биуретовая реакция.

Химизм биуретовой реакции. Биуретовая реакция выявляет в белке пептидную ( -CO-NH- ) связь. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты его неполного гидролиза (пептоны) - розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка. В щелочной среде лактимные формы образуются из лактамных форм. Биуретовая реакция схематично протекает так:

H R2 O H R4 O

| | || | | || Cu(OH)2+2NaOH

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru H2N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH- .....

| || | | || | |

R1 O H R3 O H R5

полипептид (лактамная форма)

R2 OH R4 OH

| | | |

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru H2N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH- ....

| | | | |

R1 OH R3 OH R5

полипептид (лактимная форма)

Положительную биуретовую реакцию отдельные аминокислоты не дают. Исключение: гистидин и аспарагин, с которыми биуретовая реакция происходит при условии их больших концентраций в растворе.

R2

|

R1-HC-C=N-CH-C=N-CH-R3

| | | |

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru H2N O O C-ONa

||

Cu — ―N

↑ ¦

| R4-CH

| | СOONa COONa

| C -ОNа | |

| || CH-NH2 CH-NH2

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru └ ― ― ― — N | |

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru | CH2 CH2

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru CH-R5 | N N

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru N Cu N

биуретовый медный комплекс медный комплекс с гистидином

фиолетового цвета в случае биуретовой реакции

ПРИМЕЧАНИЕ: при постановке биуретовой реакции нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Порядок выполнения работы.

Реактивы 1 пробирка 2 пробирка
Раствор белка 20 кап. 20 кап.
Порошок NaCl до полного насыщения -
Насыщенный раствор (NH4)2SO4 - 20 кап.
ФИЛЬТРОВАНИЕ
Осадок Глобулины Глобулины
  К фильтрату 1 добавить
1% раствор CH3COOH 10-20 кап. -
Порошок (NH4)2SO4 - до полного насыщения
ФИЛЬТРОВАНИЕ
Осадок Альбумины Альбумины
КОНТРОЛЬ - БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ
Фильтрат 2 5 кап. 5 кап.
10% NaOH 5 кап. 5 кап.
1% CuSO4 1 кап. 1 кап.
РЕЗУЛЬТАТЫ:        

ВЫВОД:

III.2.Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе?

Чем обусловлен коллоидный характер белковых растворов?

На чем основаны реакции осаждения белков?

Какие физико-химические свойства белков позволяют их

фракционировать?

Что такое высаливание?

С помощью какой реакции можно выявить белок

в растворе?

Какую окраску имеют белковые и безбелковые растворы

при проведении биуретовой реакции?

Какие отдельные аминокислоты могут дать

положительную биуретовую реакцию?

Чем отличаются альбумины и глобулины?

Материал для самоподготовки. I а)1. с.19-49, II, III.

Занятие № 2

ТЕМА. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ

МОЛЕКУЛ. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

Цель занятия: 1.Изучить структурную организацию белковой

молекулы как основу функционирования всех белков.

2.Ознакомиться с особенностями структуры фибриллярных

белков.

3.Освоить методы очистки белков от примесей на примере

диализа.

Исходный уровень знаний:

- аминокислоты: строение, классификация;

- ковалентные и нековалентные связи: характеристика, при-

меры;

- физико-химические свойства белков.

Содержание занятия.

I.2. Строение глобулярных белков (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры).

Особенности строения молекулы фибриллярных белков.

Взаимосвязь структуры и функции белков.

Видовая специфичность первичной структуры и антигенные свойства белков.

Методы очистки белков (хроматография, электрофорез, диализ и др.).

Гидролиз белка (виды, условия, продукты полного и неполного гидролиза).

II.1. Работа: ДИАЛИЗ БЕЛКА

Принцип метода.

Диализ основан на способности полупроницаемых мембран пропускать сквозь поры низкомолекулярные вещества и задерживать высокомолекулярные коллоидные частицы. Ди-ализ является удобным методом очистки белков. При диализе коллоидный раствор помещают в коллодиевый или целлофановый мешочек и погружают в дистиллированную или водопроводную воду. Молекулы солей, сахаров и других низкомолекулярных веществ легко диффундируют через мембраны, а вещества коллоидной природы остаются в мешочке.

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru

Рис. 1. Варианты устройства системы для диализа белка. А) диализатор из стеклянного цилиндра с дном из полупроницаемой мембраны. Б) диализатор из коллодиевого мешочка. 1-держатель, 2-диализуемый раствор, 3-диализат.

Порядок выполнения работы.

В коллодиевый мешочек (диализатор) налить 5 мл солевого раствора белка. Погрузить в стакан с дистиллированной водой на 1 час. Через час с небольшими порциями диализата (наружная жидкость) проделать реакции на хлориды и белок и убедиться в том, что минеральные соли продиффундировали во внешний сосуд, а белок остался в содержимом мешочка.

Проба на белок (биуретовая реакция).

Реактивы (кап.) 1 пробирка (диализуемый раствор) 2 пробирка (диализат)
Исследуемая жидкость
10% раствор NaOH
1% раствор CuSO4
РЕЗУЛЬТАТЫ:        
Проба на хлориды
Исследуемая жидкость
10% раствор HNO3
1% раствор AgNO3
РЕЗУЛЬТАТЫ:        

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Что такое диализ?

Что такое диализат и диализуемая жидкость?

Какие реакции используются для контроля диализа?

Как используется диализ в медицине?

Материал для самоподготовки. I а)1. с.26-32, 49-71; II; III.

Занятие № 3

ТЕМА.КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ. ХИМИЯ ПРОСТЫХ И

СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель занятия: 1.Ознакомиться с классификацией белков, харак-

теристиками отдельных групп белков и пептидов.

2.Освоить методы осаждения белков.

Исходный уровень знаний:

- строение и свойства белков;

- биологическая роль белков.

Содержание занятия.

I.2. Характеристика основных групп простых белков.

Принцип классификации сложных белков.

Характеристика природных пептидов.

Содержание белков и аминокислот в крови в норме и при патологии.

I.3. Контрольная работа.

СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ

ПО РАЗДЕЛУ "СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ"

1. Определение класса белков. Элементарный состав, наименьшая структурная единица, молекулярная масса белков.

2. Классификация аминокислот, входящих в состав белков, основанная на полярности радикалов; примеры неполярных, полярных, положительно- и отрицательно заряженных аминокислот.

3. Амфотерность и растворимость аминокислот. Функциональные группы аминокислот, участвующие в образовании ковалентных, ионных, электростатических и гидрофобных (Ван-дер-Ваальса) связей белковой молекулы.

4. Структура и название аминокислот, производных пропионовой, масляной, валериановой, капроновой, янтарной и глутаровой кислот.

5. Структура и название окси- и серусодержащих, гомо- и гетероциклических аминокислот.

6. Факторы, удерживающие белок в растворе. Изоэлектрическая точка белков. Методы осаждения белков, значение для медицины. Обратимое и необратимое осаждение. Примеры.

7. Основные физико-химические свойства белков. Свойства коллоидных растворов, отличительные от свойств истинных растворов. Методы выделения и очистки белков. Диализ, значение для медицины.

8. Методы обнаружения белков в растворе и изучения качественного состава белка. Гидролиз белка, виды гидролиза, промежуточные и конечные продукты. Применение белковых гидролизатов в лечебной практике.

9. Назовите трипептид, например:

H3C-CH-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH

| | | |

CH3 NH2 CH3 CH2

|

CH2-S-CH3

       
  раздел i. строение и свойства белков - student2.ru   раздел i. строение и свойства белков - student2.ru
 

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru -CH2-CH-CO-NH-CH-CO-N

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru | | |

NH2 (CH2)3 COOH

|

CH2NH2

10. Напишите трипептид: а) глицил-валил-изолейцин;

б) лейцил-тирозил-гистидин; в) аланил-метионил-триптофан и т.п.

11. Белки - основа жизненных процессов. Значение работ А.Я.Данилевского, Э.Фишера, Л.Полинга в формировании представлений о строении белков. Уровни структурной организации белковой молекулы.

12. Первичная структура, формирующие её связи. Зависимость биологических свойств белков от характера аминокислотной последовательности в полипептидной цепи ( HbA, HbS ).

13. Конформация пептидных цепей в белках: вторичная и третичная структуры, связи, определяющие эти структуры. Об-ратимая и необратимая денатурация белков; причины, значение.

14. Высшая форма организации белковой молекулы - четвертичная структура. Кооперативные изменения конформации протомеров (на примере гемоглобина и миоглобина).

15. Зависимость функциональных свойств белков от их конформации. Способность к специфическим взаимодействиям ("узнавание") как основа функционирования всех белков. Антигенные свойства белков.

16. Биологические функции белков. Различия белкового состава органов. Изменение белкового состава при онтогенезе и болезнях.

17. Классификация белков. Химия сложных белков. Важ-нейшие представители простых и сложных белков в организме человека.

18. Структурные белки. Классификация, особенности строения, распределение в тканях. Самосборка многомолекулярных белковых структур на примере коллагеновых волокон.

II.1. Работа № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ

Принцип метода основан на денатурации большинства белков при нагревании их растворов при температуре свыше 5О-6О0С, что приводит к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке.

Почти все белки свертываются и осаждаются при нагревании в нейтральной и слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении денатурируют, но не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли (NaCl, сернокислый аммоний и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения (+) заряда в случае сильнокислой среды и усиления (-) заряда в щелочной среде.

+H+ -H+

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru H3N+-CH-COOH H3N+-CH-COO- H2N-CH-COO-

| | |

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru R R R

молекула заряжена цвиттерионная молекула заряжена

"+" форма аминокислоты "-"

рН = 2-3 рН = 4-9 рН = 9-10

(биполярная форма)

При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении pH происходит отрыв связанного протона аминокислоты и молекула приобретает отрицательный заряд. Более полное и быстрое осаждение происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называют такое значение рН, при котором суммарный электрический заряд белка равен нулю и, следовательно, белок при этом в электрическом поле теряет подвижность, т.е. остается на старте. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (в пределах от 5,5 до 6,9).

Итак, важную роль в денатурации белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. определенная реакция среды, и присутствие солей.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.) Пробирки
1 2 3 4 5
1% раствор яичного белка
1% раствор CH3COOH - -
насыщенный раст-вор NaCl - - - -
10% раствор NaOH - - - -
КИПЯЧЕНИЕ
Реакция среды Нейт-ральная слабо-кислая сильнокислая сильнокислая, + электролит щело-чная
РЕЗУЛЬТАТЫ:            

ВЫВОД:

Работа № 2a. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ

ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Принцип метода.

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3, HgCl2), но нерастворимые в воде.

Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного (+) заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др. Обычно применяют белки молока и яиц сразу после отравления, пока эти соли еще находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за введением белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить остатки яда из организма.

Порядок выполнения работы.

Реактивы (кап.) Пробирки
1 2 3
а) Раствор яичного белка
1% раствор CuSO4 - -
5% раствор Pb(CH3COO)2 - -
5% pаствор AgNO3 - -
РЕЗУЛЬТАТЫ:        
б) продолжение опыта в тех же пробирках (добавить)
1% раствор CuSO4 5-10 - -
5% pаствоp Pb(CH3COO)2 - 5-10 -
5% pаствоp AgNO3 - - 5-10
РЕЗУЛЬТАТЫ:        

ВЫВОД:

Работа № 2б. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАН-

НЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Принцип метода.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и образуют комплексные соли белка с кислотами. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Качественная реакция с концентрированной HNО3 лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Столь-никова-Брендберга.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.) I этап II этап
Пробирки
Концентрированная HNO3 - -
Концентрированная H2SO4 - -
Раствор белка - -
Примечание: Раствор белка осторожно наслоить на кислоту по стенке пробирки, наклоненной под углом 450.
РЕЗУЛЬТАТЫ:          

ВЫВОД:

 
  раздел i. строение и свойства белков - student2.ru

Рис. 2. Наслаивание пробы на концентрированную кислоту:

1 -раствор белка; 2-кислота.

III.2. Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе?

Чем обусловлена реакция осаждения белков?

Что такое коагуляция белков? Виды коагуляции.

Что такое денатурация белка? Виды денатурации.

При каких условиях происходит: коагуляция

с денатурацией; коагуляция без денатурации;

денатурация без коагуляции?

Что такое адсорбционная пептизация?

Как используется в медицине реакция адсорбционной

пептизации?

Материал для самоподготовки: I а)1. с.19-74, 662-565. II, III.

РАЗДЕЛ II. ФЕРМЕНТЫ

Занятие № 4

ТЕМА. СТРОЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Цель занятия: 1.Повторить материал по физико-химическим

свойствам белков.

2.Ознакомиться с современными представлениями о структу-

ре ферментов, изучить их характерные свойства.

Исходный уровень знаний:

- строение и физико-химические свойства белков;

- понятие о катализаторах.

Содержание занятия.

I.2. Понятие о катализе.

Химическая природа ферментов.

Свойства ферментов.

Строение ферментов (функциональные центры, их строение).

Факторы, определяющие активность ферментов.

Витамины как коферменты.

Понятие об изоферментах.

Мультимолекулярные ферментные системы.

II.1.Работа № 1.ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА

АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода и химизм.

Амилаза слюны (a-1,4-гликозидаза) катализирует гидролиз a-1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы с промежуточным образованием декстринов различного размера. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, амилодекстрины - фиолетовое, эритродекстрины - красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза - желтое (цвет водного раствора йода, т.е. окрашивания с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала - мальтоза и глюкоза - имеют свободную альдегидную группу и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При нагревании альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь гидрата окиси меди (голубого цвета) - восстанавливается в гидрат закиси меди (желтого цвета). При дальнейшем нагревании образуется красная закись меди:

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru H O

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru C=O + 2CuSO4 + 5NaOН ® C–O–Na + 2CuOH + 2Na2SO4 + 2H2O

раздел i. строение и свойства белков - student2.ru раздел i. строение и свойства белков - student2.ru R R

Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т.е. чувствительность фермента к температуре. Для многих ферментов максимальная ферментативная скорость наблюдается при 38-400C. Эта температура называется температурным оптимумом. При нагревании свыше 700С они утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. Замедление и прекращение ферментативной реакции происходит вследствие тепловой денатурации белковой молекулы фермента. При низких температурах ферменты не денатурируются, но скорость реакции резко снижается за счет снижения кинетической энергии молекул. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.

Порядок выполнения работы:

В чистую пробирку собрать примерно 2 мл нативной (неразведенной) слюны и кипятить в течение 5 минут, охладить.

Реагенты (кап.) Пробирки
1-я 2-я 3-я
1% раствор крахмала
Нативная слюна, разведенная в 10 раз - -
Прокипяченная неразведенная слюна - -
Дистиллированная вода - -
Поместить в термостат при 380С на 10 мин. Из содержимого каждой пробирки отлить по 5 капель в дополнительные пробирки. а) йодная проба (на крахмал)
Реагенты (кап.) Пробирки
1-а 2-а 3-а
Исследуемый раствор
Раствор йода в йодистом калии
РЕЗУЛЬТАТЫ:        
б) реакция Троммера (на глюкозу и мальтозу)
Реагенты (кап.) 1-б 2-б 3-б
Исследуемый раствор
10% раствор NаОН
1% раствор CuSO4
РЕЗУЛЬТАТЫ:        

ВЫВОД:

Работа № 2. ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА АКТИВ-

НОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ОПТИМУМА рН

Принцип метода и химизм.

Для разных ферментов существует свой оптимум рН среды, когда фермент наиболее активен. Например, оптимум рН пепсина (фермент желудочного сока) - 1,5-2,0; аргиназы (фермент печени) - 9,5. Для амилазы слюны оптимум рН - 6,8-7.2; в кислой и щелочной среде активность ее снижается за счет взаимодействия белковой молекулы с ионами раствора.

Химизм реакции см. выше (раб. N1).

Порядок выполнения работы:

Слюну развести в 10 раз. Взять 5 пробирок и приготовить смеси в соответствии с таблицей (все растворы берутся в каплях).

Реактивы Пробирки
1 2 3 4 5
раствор 1
раствор 2
1% раствор NaCl
рН 5,8 6,9 7,4 7,9 8,5
0,5% раствор крахмала
Слюна разведенная
Перемешать, поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
раствор йода
Окраска              
Продукты гидролиза крахмала              

ВЫВОД:

Работа № 3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ

АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода.

Ферменты обладают специфичностью, т.к. способны катализировать только определённые химические реакции. Специфичность действия ферментов бывает абсолютная, относительная и стереохимическая. Она определяется тем, что только некоторые строго определённые функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов.

Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. Мальтаза слюны ускоряет гидролиз образующегося дисахарида мальтозы и не оказывает действия на сахарозу.

Химизм реакции см. в работе N 1.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.) 1-я пробирка 2-я пробирка
Слюна, разведенная 1:5
1% раствор крахмала -
1% раствор сахарозы -
Поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
Реактив Фелинга
Нагреть до кипения и кипятить 1 мин
РЕЗУЛЬТАТЫ:      

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Как и почему активность ферментов зависит от температуры?

Что такое температурный оптимум ферментов?

Как и почему активность ферментов зависит от рН среды

(график)?

Какие ферменты активны в кислой; нейтральной;

щелочной среде?

Что такое специфичность ферментов?

Какие виды специфичности ферментов Вы знаете?

Примеры.

Укажите качественную реакцию на крахмал.

Материал для самоподготовки: I а) 1. с.44-49, 114-129,

139-143; II; III.

Занятие № 5

ТЕМА. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ,

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия: Ознакомиться с современными представлениями о механизме действия ферментов и кинетике ферментативных реакций.

Исходный уровень знаний:

- белковая природа ферментов;

- структура сложных ферментов;

- строение молекулы фермента;

- кинетика химических реакций.

Содержание занятия.

I.2. Современные представления о механизме действия ферментов (гипотеза Фишера, Кошланда).

Полифункциональный катализ.

Кинетика ферментативных реакций. Константа Михаэлиса.

Зависимость активности ферментов от различных факторов.

Определение активности ферментов: принцип, значение в меди<

Наши рекомендации